Die Nahrungssuche von Caenorhabditis elegans folgt einer einfachen Faustregel

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Jul 22, 2023

Die Nahrungssuche von Caenorhabditis elegans folgt einer einfachen Faustregel

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 841 (2023) Diesen Artikel zitieren 921 Zugriffe auf 3 Details zu altmetrischen Metriken Faustregeln sind Verhaltensalgorithmen, die optimales Verhalten annähern

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Faustregeln sind Verhaltensalgorithmen, die ein optimales Verhalten annähern und gleichzeitig die kognitiven und sensorischen Kosten senken. Eine Möglichkeit, diese Kosten zu senken, besteht darin, die Darstellung der Umgebung zu vereinfachen: Während das theoretisch optimale Verhalten von vielen Umgebungsvariablen abhängen kann, kann eine Faustregel gelten, dass ein kleinerer Satz von Variablen verwendet werden kann, der eine einigermaßen gute Leistung erbringt. Der experimentelle Nachweis dieser Vereinfachung erfordert eine umfassende Kartierung aller relevanten Kombinationen mehrerer Umweltparameter, die wir für die Nahrungssuche von Caenorhabditis elegans durchgeführt haben, indem wir systematisch Kombinationen aus Nahrungsdichte (über 4 Größenordnungen) und Nahrungsart (über 12 Bakterienstämme) abgedeckt haben. Wir fanden heraus, dass die Reaktion der Würmer von einer einzigen Umgebungsvariablen dominiert wird: der Nahrungsdichte, gemessen als Anzahl der Bakterien pro Oberflächeneinheit. Sie lassen andere Faktoren wie Biomassegehalt oder Bakterienstamm außer Acht. Wir haben auch experimentell die Auswirkungen jeder Art von Nahrungsmitteln auf die Fitness gemessen und festgestellt, dass die Regel nahezu optimal ist und daher eine Faustregel darstellt, die die aussagekräftigste Umgebungsvariable nutzt. Diese Ergebnisse schaffen die Grundlage für weitere Untersuchungen der zugrunde liegenden genetischen und neuronalen Mechanismen, die diesen Vereinfachungsprozess steuern, und seiner Rolle bei der Entwicklung von Entscheidungsstrategien.

Ausgeklügelte und äußerst optimale Ergebnisse des Tierverhaltens ergeben sich oft aus einfachen Regeln, sogenannten Faustregeln1,2,3,4,5,6,7,8. Beispielsweise scheint das Verlassen des Beetes bei Schlupfwespen hinsichtlich mehrerer Indikatoren der Beet- und Umgebungsqualität adaptiv zu sein7, aber diese Entscheidung kann durch einen einfachen Mechanismus bestimmt werden: Eine interne Variable, die linear mit der Zeit abnimmt und stark ansteigt, wenn die Wespe einen Wirt findet . Die Wespe hinterlässt einen Patch, wenn diese Variable einen Schwellenwert8 erreicht. Obwohl diese Regel einfach zu implementieren ist, führt sie zu nahezu optimalen Antworten7,8. Die Identifizierung dieser Faustregeln ist der Schlüssel zur Verknüpfung der neuronalen und mechanistischen Umsetzung tierischen Verhaltens mit den selektiven Zwängen, die es prägen9.

Die meisten Faustregeln basieren auf einer vereinfachten internen Darstellung der Umgebung. Beispielsweise kann es für eine optimale Lebensmittelauswahl erforderlich sein, viele Variablen gleichzeitig zu berücksichtigen, wie z. B. die räumliche Verteilung der Nahrungsquellen, ihre Dichte, ihre Zusammensetzung in Bezug auf zahlreiche Nährstoffe usw. Die getrennte Verarbeitung aller dieser Variablen ist kostspielig, sodass eine Faustregel möglicherweise außer Acht gelassen wird die weniger aussagekräftigen Variablen und kombinieren den Rest zu einer oder mehreren Größen, die die interne Darstellung der Umgebung darstellen und die Entscheidung bestimmen. Während zahlreiche Studien Variablen identifizieren, die das Verhalten dominieren10, erfordert der Nachweis einer vereinfachten internen Darstellung den Nachweis, dass jede Kombination von Umgebungsvariablen, die zu derselben internen Darstellung führt, dieselbe Reaktion hervorruft. Dies ist eine Herausforderung, erstens, weil Verhaltensexperimente tendenziell eine große Variabilität aufweisen, die kleine Effekte verbergen kann, und zweitens, weil ein überzeugender Beweis systematisch eine große Anzahl äquivalenter Kombinationen testen muss. Das gleichzeitige Erreichen einer hohen Anzahl von Kombinationen und einer ausreichenden Anzahl von Wiederholungen, um ein hochpräzises Durchschnittsverhalten zu erhalten, übersteigt in den meisten Verhaltensexperimenten den experimentellen Durchsatz.

Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir eine Hochdurchsatzpipeline entwickelt, um das Futtersuchverhalten des Nematoden Caenorhabditis elegans zu untersuchen. Wir haben uns auf die Nahrungssuche (also die Nahrungssuche und -ausbeutung) konzentriert, weil sie einen deutlichen Einfluss auf die Fitness hat, der Grad des Erfolgs relativ einfach zu messen ist (anhand der Nahrungsaufnahmerate) und sie theoretisch gründlich untersucht wurde Ansicht11. Dank der hohen Nachkommenzahl und geringen Größe von C. elegans konnten wir Experimente mit mehr als 20.000 alterssynchronisierten Individuen in mehr als 2.000 Versuchsarenen durchführen. C. elegans ermöglicht nicht nur einen hohen experimentellen Durchsatz, sondern ist auch aufgrund seines kleinen Nervensystems (ca. 300 Neuronen) ein idealer Kandidat für die Umsetzung einfacher Faustregeln, während sein Nahrungssuchverhalten komplex genug ist, um die Grundelemente einer optimalen Nahrungssuche umzusetzen, was möglich ist kann zum Beispiel beim Erkunden12,13,14,15,16,17,18,19, beim Lernen20,21,22,23 und beim Füttern24,25,26,27,28,29,30,31,32,33 beobachtet werden ,34,35 Verhaltensweisen.

Wir haben die Reaktion von C. elegans auf Nahrung systematisch charakterisiert und dabei alle relevanten Kombinationen von Nahrungsdichte (über 4 Größenordnungen, von Hunger bis hin zu reichhaltiger Umgebung) und Nahrungszusammensetzung (über 12 verschiedene Bakterienstämme aus 11 verschiedenen Arten) abgedeckt. Verschiedene Bakterienstämme unterscheiden sich in ihrer Zusammensetzung hinsichtlich vieler verschiedener Moleküle sowie in ihrer Größe, Form und mechanischen Eigenschaften und umfassen eine Vielzahl von Variablen. Trotz dieser hohen Komplexität folgte die Reaktion von C. elegans auf alle unsere Bakterienstämme einem einfachen universellen Trend.

Unser Versuchsaufbau bestand aus runden Agarplatten mit 5 Nahrungsfeldern unterschiedlicher Dichte, die als regelmäßiges Fünfeck angeordnet waren (Abb. 1a). C. elegans frisst Bakterien, und jedes Nahrungsfeld war ein Tropfen einer Bakterienkultur, deren Dichte sorgfältig durch Messung der optischen Dichte (OD) angepasst wurde. Die Futterpflaster wurden am Tag vor dem Experiment angebracht und wir stellten sicher, dass die Bakteriendichte unverändert blieb, indem wir die Agarplatten ohne Nährstoffe und mit einer geringen Dosis bakteriostatischer Antibiotika präparierten. Am Tag des Experiments wurden junge erwachsene (48 Stunden alte) Würmer in der Mitte des Tellers platziert, mit gleichem Abstand zu allen Nahrungsstellen, und erkundeten die Umgebung zwei Stunden lang frei, eine Zeit, die kurz genug war, um eine nennenswerte Nahrungsaufnahme zu verhindern Erschöpfung, aber lange genug, damit die Patchbelegung am Ende des Experiments ungefähr konstant bleibt (ergänzende Abbildung 1). Wir haben ca. 10 Würmer pro Platte platziert und alle Platten mit mehr als 20 Würmern weggeworfen. Wir haben diese niedrige Anzahl von Individuen pro Teller beibehalten, um eine Erschöpfung der Nahrung zu verhindern und auch um kollektive Effekte wie die Bildung von Clustern36,37 oder Netzwerken38 zu verhindern, die höhere Wurmdichten erfordern. Um Wiederholbarkeit und einen ausreichenden Durchsatz zu gewährleisten, wurden sowohl die Futterflecken als auch die Würmer von einem Pipettierroboter auf die Platte gelegt (weitere Einzelheiten siehe Methoden).

a Experimentelles Schema: Würmer werden in der Mitte eines regelmäßigen Fünfecks platziert, das aus 5 Nahrungsfeldern unterschiedlicher Dichte besteht. Nach 2-stündiger Erkundung werden die Würmer, die sich an jedem Nahrungsfleck befinden, gezählt. b Relative Anzahl der Würmer, die an jedem Nahrungsbeet gefunden wurden, als Funktion der Bakteriendichte im Nahrungsbeet (D). Quadrate: Experimentelle Daten für E. coli OP50. Linie: Angepasstes Sigmoid gemäß Gl. 1 in Methoden. c Sigmoid-Parameter: \(H\) ist das Verhältnis zwischen der Anzahl der Würmer an den Extrempunkten hoher und niedriger Dichte, \(k\) ist die Steigung am Mittelpunkt des Sigmoids und \({D}_{{{\mbox {attract}}}}\) ist die Dichte, bei der die Anzahl der Würmer das Fünffache der Basislinie niedriger Dichte erreicht. d Wie (b), aber für alle Bakterienstämme und ohne Fehlerbalken (siehe ergänzende Abbildung 4 für separate Diagramme für jeden Stamm und ergänzende Abbildung 5 für die Parameter aller Sigmoide) e Gemessener Anteil der Würmer in jedem Nahrungsbeet im Vergleich zu vom Sigmoid vorhergesagter Anteil, angepasst an jeden Stamm (Gleichungen 1 und 2). f Relative Anzahl der Würmer, die an jedem Nahrungsfeld gefunden werden, als Funktion der effektiven Dichte (\({D/D}_{{attract}}\)). Schwarze Linie: Sigmoid mit \(H=146\), \(k=1,4\). g Wie (e), jedoch mit Vorhersagen unter Verwendung der effektiven Dichte und des gleichen Sigmoids für alle Stämme. Alle Fehlerbalken zeigen das 95 %-Konfidenzintervall, berechnet durch Bootstrapping; Stichprobengrößen finden Sie in der Ergänzungstabelle 1.

Eine wesentliche Herausforderung bestand darin, einen ausreichend großen Bereich der Bakteriendichten zu untersuchen, da das Platzieren von Flecken mit sehr unterschiedlicher Dichte auf derselben Platte zu verrauschten Daten führt: Würmer sammeln sich auf den Flecken mit hoher Dichte an, so dass nur sehr wenige Personen den Bereich mit niedriger Dichte beurteilen können . Wir haben diese Herausforderung gelöst, indem wir mehrere Experimente durchgeführt haben, die kleinere und überlappende Dichtebereiche abdecken. Zur Visualisierung haben wir die Anzahl der Würmer in jedem Experiment in Bezug auf eine virtuelle Referenz normalisiert, um eine relative Anzahl von Würmern zu erhalten, die über alle Bedingungen hinweg vergleichbar ist (Ergänzende Abbildungen 2, 3 und Methoden).

Wir fanden heraus, dass die relative Anzahl der Würmer an einem Futterplatz mit der Bakteriendichte zunimmt und einem sigmoidalen Trend folgt, der sich am besten in einem doppelt-logarithmischen Diagramm veranschaulichen lässt (Abb. 1b). Während unsere Ergebnisse qualitativ mit früheren Studien vergleichbar sind19,30,32,34, ermöglichte unser hoher Durchsatz eine quantitative Beschreibung und zeigte, dass die Präferenz von C. elegans durch eine mathematische Formel mit drei Parametern gut beschrieben wird (Abb. 1c; Gleichung 1 in). Methoden): Die Höhe des Sigmoids (genannt \(H\) und definiert als das Verhältnis zwischen der Anzahl der Würmer im Extremfall hoher und niedriger Dichte), die Geschwindigkeit, mit der die Anzahl der Würmer mit der Bakteriendichte zunimmt (genannt \( k\) und definiert als die Steigung am Mittelpunkt des Sigmoids) und die Bakteriendichte, bei der das Sigmoid zu wachsen beginnt (genannt \({D}_{{{\mbox{attract}}}}\) und definiert als Dichte, bei der die Anzahl der Würmer das Fünffache der Anzahl an Würmern an Stellen ohne Bakteriendichte erreicht). Wir können diesen letzten Parameter als die minimale Bakteriendichte verstehen, die erforderlich ist, um die Würmer signifikant anzulocken, daher haben wir ihn Anziehungsdichte genannt. Nach Anpassung dieser drei Parameter beschreibt unser Sigmoid die experimentellen Daten (Abb. 1b, schwarze Linie).

Um zu untersuchen, ob unsere Ergebnisse auf verschiedene Arten von Lebensmitteln anwendbar sind, haben wir unsere Experimente mit 12 verschiedenen Stämmen durchgeführt, verteilt auf 11 Arten und 7 Familien. Fünf dieser Stämme kommen in C. elegans-Studien häufig vor, während es sich bei den restlichen sieben Stämmen um Bakterien handelt, die wir aus dem Darm von C. elegans-Würmern isoliert haben, die im Labor auf verschiedenen Arten von natürlichem Kompost gezüchtet wurden (siehe Methoden).

Wir fanden heraus, dass die Reaktionen von C. elegans auf alle Bakterienstämme durch unsere Sigmoidalgleichung beschrieben werden können, nachdem die drei Parameter für jeden Stamm unabhängig angepasst wurden (Abb. 1d und ergänzende Abbildungen 4, 5). Um die Gesamtgüte dieser Anpassung zu quantifizieren, haben wir den Anteil der Würmer an jedem Nahrungsfeld für jede Versuchsbedingung mit den Vorhersagen unseres Sigmoidalmodells verglichen (ergänzende Abbildung 2b). Wir haben eine hervorragende Übereinstimmung erzielt, da unser Modell 93 % der gesamten experimentellen Varianz beschreibt (Abb. 1e).

Die in Abb. 1d gezeigten Sigmoide sehen bemerkenswert ähnlich aus. Ihr größter Unterschied besteht in einer horizontalen Verschiebung, die durch die Anziehungsdichte (\({D}_{{{\mbox{attract}}}}\)) gesteuert wird. Tatsächlich haben wir herausgefunden, dass die Unterschiede zwischen Bakterienstämmen in den Parametern \(H\) und \(k\) gering sind, während \({D}_{{{\mbox{attract}}}}\) sich um bis zu 50 % unterscheidet. über die Stämme falten (Ergänzende Abbildung 5).

Wir stellten die Hypothese auf, dass C. elegans die Unterschiede zwischen Bakterienstämmen einfach durch die Berechnung einer effektiven Dichte und die Reaktion darauf beheben könnte. Wir definierten die effektive Dichte als \(D/{D}_{{{\mbox{attract}}}}\) und stellten fest, dass diese Neuskalierung der Bakteriendichte die meisten Unterschiede zwischen den Bakterienstämmen beseitigte (Abb. 1f). . Wir haben daher alle unsere Daten mit einem einzigen Sigmoid neu angepasst, um alle Stämme mit denselben Parametern zu beschreiben (\(H=146\), \(k=1,4\), schwarze Linie in Abb. 1f). Dieses gemeinsame Sigmoid beschreibt alle unsere Daten fast so genau wie die einzelnen Anpassungen (Abb. 1g).

Wir fragten dann, ob die Reaktion von C. elegans gut geeignet war, die Nahrungsflächen auszuwählen, die seine Fitness maximierten. Um abzuschätzen, wie sich ein Zeitraum der Nutzung eines bestimmten Nahrungsgebiets auf die Fitness von C. elegans auswirkt, haben wir die Anzahl der Eier gezählt, die von einem einzelnen Wurm gelegt wurden, der sich 5 Stunden lang von einem Nahrungsgebiet ernährt. Um den Effekt der Nahrungspräferenz so weit wie möglich zu beseitigen, umschlossen wir das Nahrungsfeld mit einem Kupferring, der den Wurm am Entweichen hinderte und ihn zwang, unabhängig von seiner Präferenz auf dem Nahrungsfeld zu bleiben (Abb. 2a). Wir fanden heraus, dass Würmer auch ohne Nahrung durchschnittlich 3 Eier legen, die wahrscheinlich produziert wurden, als die Würmer vor Beginn des Tests OP50 mit hoher Dichte fraßen. Die Anzahl der Eier stieg in Gegenwart von Nahrung über diesen Ausgangswert hinaus an und erreichte bei hoher Nahrungsdichte einen Durchschnitt von 20 Eiern. Diese hohe Anzahl an Eiern erfordert eine aktive Eiproduktion während des Tests, da wohlgenährte junge erwachsene Hermaphroditen normalerweise 10–15 Eier in ihrer Gebärmutter speichern und nur ein Bruchteil davon reif ist39. Die Anzahl der Eier stieg bei einer bestimmten Nahrungsdichte, die wir \({D}_{{{\mbox{Fitness}}}}\ nannten, stark an und stabilisierte sich bei höheren Dichten (Abb. 2b).

Ein experimentelles Schema zur Abschätzung der Auswirkungen auf die Fitness: Ein einzelner Wurm wurde in die Mitte eines Nahrungsfeldes gelegt und mit einem Kupferring umgeben, um ihn am Entkommen zu hindern. Fünf Stunden später wurde die Anzahl der Eier gezählt. b Anzahl der nach 5 Stunden auf einer Nahrungsfläche von DA1885 gelegten Eier als Funktion der Dichte der Nahrungsfläche (offene Kreise). Gepunktete horizontale Linie: durchschnittliche Anzahl Eier, wenn kein Futter vorhanden war. Gestrichelte horizontale Linie: Schwellenwert, der bestimmt wird, wann die Anzahl der Eier im Vergleich zum Null-Nahrungsmittel-Grundwert ansteigt. Durchgezogener Punkt: Punkt, an dem die Anzahl der Eier den Schwellenwert überschreitet, der \({D}_{{{\mbox{fitness}}}}\ definiert. c Wie (b), jedoch für 11 Bakterienstämme und ohne Fehlerbalken. d Dichte, bei der Würmer beginnen, mehr Eier zu legen (\({D}_{{{\mbox{fitness}}}}\)), versus Dichte, bei der Würmer beginnen, von einem Nahrungsfeld angelockt zu werden (\({D}_ {{{\mbox{attract}}}}\)). Die Linie zeigt die perfekte Proportionalität zwischen den beiden Variablen an (\({D}_{{{\mbox{fitness}}}}=0,2{D}_{{{\mbox{attract}}}}\); der Wert der Die Proportionalitätskonstante hat kaum Konsequenzen, da sie von den Schwellenwerten abhängt, die zur Definition von \({D}_{{{\mbox{attract}}}}\) und \({D}_{{{\mbox{fitness}} gewählt werden. }}\)). Farbe und Form aller Marker kennzeichnen den Bakterienstamm gemäß der Legende in Abb. 1. Alle Fehlerbalken zeigen 95 %-Konfidenzintervalle, berechnet über Bootstrapping; Stichprobengrößen finden Sie in der Ergänzungstabelle 1 und in den Ergänzungsdaten 1 finden Sie die Daten und den Computercode, die diese Zahl generieren.

Die Eiablage nimmt mit der Bakteriendichte zu und folgt bei allen Stämmen einem ähnlichen Trend. Der Hauptunterschied besteht in einer Verschiebung der Dichte, bei der der Anstieg stattfindet (\({D}_{{{\mbox{fitness}}}}\) ) (Abb. 2c). Daher sollte eine optimale Verhaltensreaktion zur Maximierung der Eiproduktion auch bei allen Stämmen mit einer Verschiebung der Dichte dem gleichen Trend folgen, was wir für die Belegung der Beete festgestellt haben (Abb. 1). Die Frage ist, ob die Dichteverschiebungen bei der Nahrungspräferenz (gekennzeichnet durch die Anziehungsdichte \({D}_{{{\mbox{attract}}}}\)) denen entsprechen, die bei der Eiablage auftreten (gekennzeichnet durch \({ D}_{{{\mbox{Fitness}}}}\)). Wir haben festgestellt, dass dies der Fall ist: \({D}_{{{\mbox{fitness}}}}\) und \({D}_{{{\mbox{attract}}}}\) sind proportional ( p = 0,03, lineare Regression), was in einem Log-Log-Plot einer Linie mit der Steigung 1 entspricht (schwarze Linie in Abb. 2d).

Drei Ausreißer weichen vom allgemeinen Trend ab (Abb. 2d). Einer dieser Ausreißer ist E. coli OP50, der vor dem Experiment auch zur Fütterung der Würmer verwendet wurde. Diese frühere Erfahrung könnte die Abweichung erklären, da C. elegans Gerüche und Geschmäcker erlernen kann, die mit nützlichen Nahrungsmitteln verbunden sind20,22, und dieses Lernen könnte die Attraktivität von OP50 gegenüber unbekannten Stämmen erhöhen. Die anderen beiden Ausreißer (Bacillus safensis CR164 und Pseudomonas viridiflava CR90) können auf diese Weise nicht erklärt werden. Diese Abweichungen deuten darauf hin, dass das Verhalten von C. elegans nahezu optimal, aber nicht vollkommen optimal ist, obwohl wir bedenken müssen, dass wir nur einen Indikator für die Fitness messen (Anzahl der in 5 Stunden gelegten Eier), und eine genauere Messung könnte dies teilweise erklären die Ausreißer. Auf jeden Fall kommen wir zu dem Schluss, dass C. elegans eine Faustregel anwendet, indem er sich auf Hinweise konzentriert, die es ihm ermöglichen, sein Verhalten an die meisten Stämme anzupassen, und wahrscheinlich andere vernachlässigt, die für die Ausreißer relevant wären.

Als nächstes fragten wir, welche Eigenschaften des Lebensmittels die beobachtete Faustregel bestimmen. Wir stellten zunächst die Hypothese auf, dass Würmer die Nahrungsflächen mit der höchsten Biomassedichte auswählen würden, da die Biomassedichte die tatsächlich verfügbare Nahrungsmenge bestimmt. Bisher haben wir die Bakteriendichte mithilfe der optischen Dichte (OD) angegeben, die die von einer Bakterienkultur absorbierte Lichtmenge misst. Die OD ist für einen bestimmten Bakterienstamm proportional zur Biomassedichte, aber verschiedene Bakterienstämme haben unterschiedliche Zellgrößen, -formen und -zusammensetzungen, die sich auf die Lichtdurchlässigkeit durch die Kultur auswirken. Daher können Kulturen verschiedener Stämme bei gleicher OD eine unterschiedliche Biomassedichte aufweisen. Wir stellten die Hypothese auf, dass die unterschiedlichen Werte der Anziehungsdichte (\({D}_{{{\mbox{attract}}}}\)) in Bezug auf die OD tatsächlich denselben Dichteschwellenwert in Bezug auf die Biomasse widerspiegeln könnten.

Um die Biomassedichte jedes Bakterienstamms zu messen, haben wir die Beziehung zwischen Biomassegehalt und OD bestimmt. Dazu haben wir das Gewicht der trockenen Biomasse gemessen, die nach der Verdunstung des gesamten in den Bakterienkulturen aller unserer Stämme enthaltenen Wassers übrig blieb. Wenn Biomasseunterschiede unsere Ergebnisse erklären würden, sollten wir eine umgekehrte Beziehung zwischen Biomassegehalt und \({D}_{{{\mbox{attract}}}}\ finden, da Stämme mit doppelt so viel Biomasse bei OD = 1 sollten eine doppelt so große effektive Dichte haben und daher sollte ihre Anziehungsdichte (\({D}_{{{\mbox{attract}}}}\)) halbiert werden.

Wir haben zwar eine leicht negative Korrelation (p = 0,05, lineare Regression) zwischen dem Biomassegehalt und \({D}_{{{\mbox{attract}}}}\ gefunden, diese Korrelation ist jedoch viel zu schwach, um die Unterschiede zu erklären über Bakterienstämme hinweg: Die Biomassedichte ändert sich zwischen verschiedenen Stämmen um weniger als das Dreifache, während sich \({D}_{{{\mbox{attract}}}}\) bis zum 50-fachen ändert (Abb. 3a; bei Unterschieden in der Biomassedichte Unterschiede in \({D}_{{{\mbox{attract}}}}\ erklären sollten, sollten die Datenpunkte der schwarzen Diagonale folgen, die in diesem Log-Log-Diagramm die Steigung -1 hat). Tatsächlich verbessert die Verwendung der Biomassedichte anstelle der OD die Vorhersagen der Flächenbelegung nicht (ergänzende Abbildung 6). Daher ist die Biomassedichte nicht der Hauptfaktor für die Nahrungsauswahl bei C. elegans.

Farbe und Form der Marker identifizieren Bakterienstämme (siehe Legende in Abb. 1). eine Biomassedichte für jeden Stamm bei OD = 1 (gemessen in Gramm Trockengewicht, gDW, pro Liter) im Vergleich zu seiner Anziehungsdichte (\({D}_{{{\mbox{attract}}}}\)). Schwarze Linie: Inverse Beziehung (proportional zu 1/\({D}_{{{\mbox{attract}}}}\)), die darauf hinweisen würde, dass die Biomassedichte für die beobachteten Unterschiede in \({D}_ verantwortlich ist {{{\mbox{anziehen}}}}\). b Anzahl der Zellen pro Mikroliter bei OD = 1 für jeden Stamm, versus \({D}_{{{\mbox{attract}}}}\) für jeden Stamm. Schwarze Linie: Inverse Beziehung (proportional zu 1/\({D}_{{{\mbox{attract}}}}\)), die angibt, dass die Anzahl der Zellen für die beobachteten Unterschiede in \({D} verantwortlich ist. _{{{\mbox{anziehen}}}}\). c Relative Anzahl der Würmer, die an jedem Nahrungsbeet gefunden wurden, als Funktion der Bakteriendichte (gemessen in Zellen/mm2) im Nahrungsbeet. Schwarze Linie: Sigmoid, an alle Stämme angepasst. d Gemessener Anteil an Würmern in jedem Nahrungsfeld im Vergleich zum durch das Sigmoid in (c) vorhergesagten Anteil. Alle Fehlerbalken zeigen das 95 %-Konfidenzintervall, berechnet durch Bootstrapping; Stichprobengrößen finden Sie in der Ergänzungstabelle 1 und in den Ergänzungsdaten 1 finden Sie die Daten und den Computercode, die diese Zahl generieren.

Als nächstes stellten wir die Hypothese auf, dass die Zelldichte die Präferenz bestimmen könnte. Aus den gleichen Gründen, die im vorherigen Abschnitt erläutert wurden, weisen verschiedene Bakterienstämme bei gleicher OD eine unterschiedliche Zelldichte (dh Anzahl der Zellen pro Volumeneinheit) auf. Wir haben die Zelldichte in unseren Kulturen durch eine Kombination aus Ausplattieren und mikroskopischen Beobachtungen bestimmt (siehe Methoden). Was die Biomasse betrifft, erwarteten wir eine umgekehrte Beziehung zwischen \({D}_{{{\mbox{attract}}}}\) und der Zelldichte bei OD = 1.

Wir fanden eine ausgezeichnete inverse Korrelation zwischen \({D}_{{{\mbox{attract}}}}\) und der Zelldichte bei OD = 1 (p = 0,002, lineare Regression), und in diesem Fall war die Korrelation stark genug, um die gesamte Variabilität in \({D}_{{{\mbox{attract}}}}\) zu erklären (Abb. 3b). Dieses Ergebnis zeigt, dass die effektive Dichte, die das Verhalten von C. elegans steuert, einfach die Bakteriendichte ist, gemessen jedoch in der Anzahl der Zellen pro Volumeneinheit (oder in der Anzahl der Zellen pro Oberflächeneinheit, sobald die Bakterien auf der Oberfläche der Agarplatte platziert sind). ). Wir haben diese Tatsache bestätigt, indem wir unsere Originaldaten mit der in Zellen/mm2 gemessenen Bakteriendichte grafisch dargestellt und sie mit einem einzelnen Sigmoid verglichen haben (Abb. 3c).

Daher beschreibt eine Regel, die ein Nahrungsfeld ausschließlich durch seine Dichte in Zellen/mm2 charakterisiert (ohne zwischen Bakterienstämmen zu unterscheiden), die experimentellen Ergebnisse mit hoher Genauigkeit (Abb. 3d). Allerdings stellen wir einen leichten Rückgang der Genauigkeit fest: Unser vorheriges Modell erklärte 90 % der gesamten experimentellen Varianz (\({R}^{2}=0,9\), Abb. 1g), während das aktuelle Modell 80 % davon erklärt (\({R}^{2}=0,8\), Abb. 3d). Dieser Rückgang der Genauigkeit ist wahrscheinlich auf eine Kombination aus zwei Problemen zurückzuführen: Erstens können neben der Bakterienzelldichte auch andere Faktoren zur effektiven Dichte beitragen, die das Verhalten von C. elegans bestimmt, sodass dieser Rückgang der Genauigkeit möglicherweise die tatsächliche biologische Komplexität widerspiegelt. Zweitens hat unser aktuelles Modell die an unsere Verhaltensergebnisse angepassten \({D}_{{{\mbox{attract}}}}\) durch eine unabhängige Messung der Zelldichte jedes Bakterienstamms und des Experiments ersetzt Ungenauigkeiten dieser separaten Messung müssen zwangsläufig die Genauigkeit der Gesamtpassung beeinträchtigen.

Auf jeden Fall deuten unsere Ergebnisse deutlich darauf hin, dass mindestens 90 % der Reaktion von C. elegans auf Bakterien durch eine effektive Dichte bestimmt werden (Abb. 1g) und dass mindestens 80 % der Reaktion durch eine einzige Umgebungsvariable erklärt werden können ( Bakterienzelldichte, Abb. 3d), die hinsichtlich des Fitnessvorteils am aussagekräftigsten ist (im Vergleich zu Alternativen wie der Biomassedichte).

Alle bisherigen Ergebnisse beziehen sich auf Experimente, bei denen Würmer jeweils einem einzelnen Bakterienstamm ausgesetzt waren. Als nächstes testeten wir, ob unsere Regel die Flächenbelegung in Umgebungen vorhersagen kann, die Nahrungsflächen verschiedener Arten enthalten. Um dies zu testen, verwendeten wir Escherichia coli OP50 sowie zwei weitere Stämme, DA1880 und CR266, die wir ausschließlich nach dem Kriterium ausgewählt haben, Werte von \({D}_{{{\mbox{attract}}}}\) (as) aufzuweisen berichtet in der ergänzenden Abbildung 5c) und deckt einen weiten Bereich ab. Anschließend führten wir Experimente mit fünf Beeten verschiedener Arten und unterschiedlicher Dichte durch (Abb. 4a), zeichneten die Anzahl der Würmer an jedem Futterbeet nach 2 Stunden auf und verglichen diese Ergebnisse mit den von unserem Modell vorhergesagten Ergebnissen (unter Verwendung derselben Parameter wie in Abb. 1f). Wir haben dieses Experiment für viele verschiedene Dichtekombinationen der drei Bakterienstämme durchgeführt (ergänzende Abbildung 7) und dabei eine gute Gesamtübereinstimmung zwischen Vorhersagen und experimentellen Ergebnissen erhalten (Abb. 4b, c).

a Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus: Wir platzierten 5 Futterflächen unterschiedlicher Dichte und verschiedener Bakterienarten und zählten nach 2 Stunden die Anzahl der Würmer pro Fläche. b Relative Anzahl der Würmer, die an jedem Nahrungsfeld gefunden werden, als Funktion der effektiven Dichte (\({D/D}_{{attract}}\)). Schwarze Linie: Sigmoid mit \(H=146\), \(k=1,4\). c Gemessener Anteil der Würmer in jedem Nahrungsfeld im Vergleich zum Anteil, der vom Sigmoid unter Verwendung der effektiven Dichte und der gleichen Parameter wie in Kasten b vorhergesagt wurde. Siehe ergänzende Abbildung 7 für nach Bedingungen getrennte Ergebnisse, ergänzende Tabelle 1 für Stichprobengrößen und ergänzende Daten 1 für die Daten und den Computercode, die diese Zahl generieren. Alle Fehlerbalken sind 95 %-Konfidenzintervalle, die per Bootstrapping berechnet werden.

Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass C. elegans lediglich die Anzahl der pro Flächeneinheit angetroffenen Bakterien misst, wenn es darum geht, ein Nahrungsfeld weiter zu nutzen oder es zu verlassen. Dieses Ergebnis führt zu einer interessanten Vorhersage, die wiederum einen stärkeren Test unserer Hypothesen ermöglicht. Betrachten wir ein Lebensmittelbeet, in dem zwei Bakterienstämme gut vermischt sind. Ein Wurm, der dieses Nahrungsgebiet erkundet, wird gleichzeitig beiden Stämmen ausgesetzt, sodass alle Faktoren wie unterschiedliche Zellzusammensetzung, unterschiedliche Zellgröße oder unterschiedliche Metaboliten nahezu gleichzeitig wahrgenommen werden. Wir wissen nicht, wie sich diese Reize im Nervensystem von C. elegans verbinden. Wenn sie also eine wichtige Rolle spielen, wäre es schwierig, die Reaktion von C. elegans auf ein gemischtes Futterpflaster vorherzusagen. Als Referenz definieren wir ein sinnvolles Nullmodell, wobei wir davon ausgehen, dass die Reaktion auf ein gemischtes Nahrungsmittelpflaster ein Durchschnitt der Reaktionen auf die entsprechenden reinen Nahrungsmittelpflaster wäre, gewichtet nach ihren relativen Anteilen in der Mischung. Daher definieren wir unser Nullmodell als jedes Ergebnis zwischen den gewichteten arithmetischen und geometrischen Mitteln der Antworten auf jede einzelne Belastung (Abb. 5a).

a Relative Anzahl von Würmern, vorhergesagt durch das Sigmoidalmodell für Flecken von DA1885 (dunkelblau) und CR266 (hellblau), als Funktion der Bakteriendichte (gemessen in OD). Unser Experiment fand bei OD = 0,5 (schwarze gestrichelte Linie) statt, wobei DA1885 etwa zehnmal attraktiver ist als CR266 (Kreise). Das Nullmodell für eine 50:50-Mischung beider Stämme reicht vom geometrischen Mittel zum arithmetischen Mittel der beiden reinen Patches (schwarzer Fehlerbalken). b Relative Anzahl von Würmern in einem Nahrungsbeet als Funktion seiner effektiven Bakteriendichte (\({D/D}_{{{\mbox{attract}}}}\)). Kreise: Effektive Dichte für CR266 und DA1885 bei OD = 0,5. Rotes Kreuz: Effektive Bakteriendichte für eine 50:50-Mischung aus CR266 und DA1885 bei OD = 0,5 (die effektive Dichte der 50:50-Mischung ist das arithmetische Mittel beider effektiver Dichten, das im logarithmischen Maßstab näher am höchsten liegt eins). c Versuchsschema: Würmer wurden 5 Nahrungsflächen mit unterschiedlichen Anteilen von CR266 und 1885 ausgesetzt, immer bei OD = 0,5. Die Würmer an jedem Fleck wurden nach 2 Stunden gezählt. d Anzahl der Würmer an jedem Nahrungsbeet als Funktion des DA1885-Anteils im Nahrungsbeet. Punkte: Experimentelle Ergebnisse (Fehlerbalken zeigen das 95 %-Konfidenzintervall, berechnet über Bootstrapping). Rote Linie: Vorhersage aus dem Sigmoidalmodell. Grauer Fleck: Vorhersage des Nullmodells. Siehe Ergänzungstabelle 1 für Stichprobengrößen und Ergänzungsdaten 1 für die Daten und den Computercode, die diese Zahl generieren.

Wenn dagegen die Reaktion von C. elegans durch die Zelldichte des Nahrungsbeetes bestimmt wird, können wir die Reaktion auf jedes gemischte Beet vorhersagen, indem wir dessen effektive Dichte berechnen (die aufgrund der Zelldichte der Durchschnitt der effektiven Dichten beider Stämme ist). ist additiv) und verwenden Sie unser Sigmoidalmodell, um die Reaktion des Wurms darauf vorherzusagen (Abb. 5b). Durch die Auswahl von Paaren von Bakterienstämmen mit sehr unterschiedlichem \({D}_{{{\mbox{attract}}}}\ können wir Fälle haben, in denen diese vorhergesagte Reaktion stark vom Nullmodell abweicht (vergleiche Abb. 5a). und Abb. 5b).

Um diese Vorhersagen zu testen, führten wir Experimente mit Lebensmittelbeeten durch, die Mischungen aus CR266 mit einem hohen \({D}_{{{\mbox{attract}}}}\ und DA1885 mit einem niedrigen \({ D}_{{{\mbox{anziehen}}}}\). Wir haben Kulturen bei OD = 0,5 für beide Stämme hergestellt und 5 Mischungen mit Verhältnissen DA1885:CR266 von 0:1, 0,125:0,875, 0,25:0,75, 0,5:0,5 und 1:0 hergestellt. Da beide Reinkulturen eine OD = 0,5 hatten, hatten alle 5 Mischungen auch eine OD = 0,5 (Bereich 0,49–0,51). Anschließend führten wir unser Experiment durch und ließen die Würmer zwischen fünf Nahrungsfeldern wählen, die aus diesen fünf Mischungen hergestellt wurden (Abb. 5c).

Die experimentellen Ergebnisse folgen den Vorhersagen des Sigmoidalmodells und lehnen das Nullmodell eindeutig ab (Abb. 5d). Aufgrund seiner Konstruktion stimmt unser Nullmodell genau mit den experimentellen Daten für die beiden Einzelarten-Patches (Fraktionen 0 und 1) überein, weicht jedoch sehr weit von den experimentellen Daten für die gemischten Patches ab. Neben dem hier vorgestellten Stammpaar haben wir noch drei weitere Paare (insgesamt vier) gemessen. Drei der vier Paare zeigten eine hervorragende Übereinstimmung mit unseren Vorhersagen, und in allen Fällen fanden wir eine bessere Übereinstimmung mit unseren Vorhersagen als mit dem Nullmodell (ergänzende Abbildung 8).

In unseren Experimenten wurde die Reaktion von C. elegans auf Nahrung bei allen Bakterienarten durch eine einzige Variable bestimmt: die effektive Nahrungsdichte. Diese effektive Dichte scheint der bakteriellen Zelldichte (dh der Anzahl der Zellen pro Oberflächeneinheit) zu entsprechen, wobei andere Faktoren, die vom Bakterienstamm abhängen, wie z. B. der Biomassegehalt, geringere Auswirkungen haben.

Unsere experimentellen Ergebnisse scheinen früheren Studien zu widersprechen, stimmen aber tatsächlich mit ihnen überein. Frühere Studien34,35 zeigten große Präferenzunterschiede zwischen bestimmten Stämmen, wie E. coli Hb101 und E. coli DA837, der OP50 sehr ähnlich ist und die gleiche Verhaltensreaktion hervorruft (ergänzende Abbildung 9). Im Gegensatz dazu fanden wir nur moderate Unterschiede zwischen Hb101 und OP50. Studien, die größere Unterschiede zeigten, wurden jedoch auf Nähragarplatten durchgeführt, auf denen Bakterien wachsen konnten, nachdem sie auf der Platte abgelagert wurden. OP50 ist ein Uracil-Auxotroph, und diese Tatsache begrenzt sein Wachstum auf festen Medien, während Hb101 dieser Einschränkung nicht unterliegt und auf Agarplatten zu höheren Dichten wächst. Daher können die in früheren Studien beobachteten Unterschiede zwischen den Stämmen auf Unterschiede in der Bakteriendichte zurückgeführt werden. Ein weiterer offensichtlicher Widerspruch ist der Beweis, dass weniger bevorzugte Bakterien für C. elegans schwer zu fressen sind34,40. Wir würden nicht erwarten, dass eine Erhöhung der Dichte schwer zu verzehrender Bakterien diese genauso profitabel machen würde wie leichter zu verzehrende Stämme, daher stellt die Regelmäßigkeit unserer Ergebnisse diese frühere Feststellung in Frage. Allerdings wurde angenommen, dass einige Bakterienstämme vor allem deshalb schwerer zu fressen seien, weil sie eine größere Zellgröße hätten34,40 und Stämme mit größeren Zellgrößen hätten bei Sättigung tendenziell eine geringere Zelldichte. Daher korrelierten die in früheren Studien beobachteten Unterschiede auch mit der Zelldichte. Ein letzter offensichtlicher Widerspruch ergibt sich aus Studien, die gezeigt haben, dass S. marcescens (Db10) ein Krankheitserreger von C. elegans ist und von den Würmern aktiv gemieden wird41,42. Ein solches Vermeidungsverhalten haben wir nicht gefunden, aber sowohl die starke Pathogenität als auch die Vermeidungsreaktion erfordern eine aktive Produktion eines Toxins durch die Bakterien, was unter unseren Versuchsbedingungen aufgrund des Mangels an Nährstoffen in den Platten nicht möglich war. Als Kontrolle überprüften wir, ob wir die Vermeidung von S. marcescens durch C. elegans reproduzieren konnten, wenn wir Experimente auf NGM-Platten und nicht auf unseren Versuchsplatten durchführten (ergänzende Abbildung 10). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Entdeckung der Faustregel für die Nahrungssuche von C. elegans eine genaue Kontrolle der Bakteriendichte und die Entkopplung der Wirkung von Toxinen und anderen Metaboliten erforderte.

Es bleibt eine offene Frage, welche Mechanismen für die Reaktion von C. elegans auf die Bakterienzellzahl verantwortlich sind. Eine mögliche Hypothese wäre, dass die Bakterienzahl für C. elegans die einfachste Möglichkeit ist, die Bakteriendichte abzuschätzen. C. elegans scheint die Nahrungsverfügbarkeit anhand der Nahrungsmenge abzuschätzen, die pro Zeiteinheit durch sein Mahlwerk aufgenommen wird31,43, und diese Messung könnte auf der Anzahl der verschluckten einzelnen Körper beruhen. Diese Hypothese würde jedoch nicht erklären, warum C. elegans unabhängig von der Biomassedichte mehr Eier legt, wenn er sich von Nahrungsflächen mit hoher Zelldichte ernährt. Zwei alternative Hypothesen würden mit diesem Ergebnis übereinstimmen: Erstens könnte es sein, dass bestimmte Schlüsselnährstoffe von den Bakterien Zelle für Zelle produziert werden und dass die Anziehungskraft von C. elegans auf Nahrung und seine Fähigkeit zur Eiablage miteinander korrelieren mit ihrer Konzentration. Zweitens könnte es sein, dass eine hohe Zellzahl es C. elegans erleichtert, Bakterien zu finden und zu verzehren. Dies kann insbesondere bei geringen Bakteriendichten von Bedeutung sein: Bei einer Dichte von beispielsweise 104 Zellen/mm2 ist nur etwa 1 % der Oberfläche eines Lebensmittelbeetes tatsächlich von Bakterien bedeckt. Daher müssen Würmer bei dieser Dichte einzelne Zellen oder kleine Zellhaufen finden, die dünn verteilt sind. Der Erfolg dieser Suche könnte der Schlüsselfaktor für die Fütterungsrate von C. elegans sein und würde eher von der Zellzahl als von der Gesamtbiomassedichte abhängen. Wir haben derzeit nicht genügend Beweise, um zwischen diesen beiden Hypothesen zu entscheiden.

Die Rolle der Sauerstoffkonzentration verdient einen gesonderten Kommentar, da sich unsere Ergebnisse in dieser Hinsicht von den meisten früheren Studien unterscheiden. C. elegans wird von niedrigen Sauerstoffkonzentrationen angezogen, möglicherweise um Nahrung zu finden (da dichte Bakterienpopulationen den Sauerstoff in ihrer unmittelbaren Umgebung verbrauchen)32,44,45,46. Die meisten früheren Studien zur Nahrungssuche von C. elegans verwendeten Bakterienflecken, die auf reichhaltigen Medien (normalerweise NGM21,24,26,29,34,44,45,46 oder NGM14,32 mit niedrigem Peptongehalt, wo Bakterien noch wachsen können) wachsen, wo der Bakterienstoffwechsel stattfindet ist aktiv und Bakterien verbrauchen daher aktiv Sauerstoff. Im Gegensatz dazu fanden unsere Experimente auf Platten ohne Nährstoffe für die Bakterien und mit geringen Mengen bakteriostatischer Antibiotika statt, um sicherzustellen, dass die Bakteriendichte während der 24 Stunden zwischen der Ablagerung der Bakterientropfen und dem Verhaltensexperiment konstant blieb. Aus diesem Grund gehen wir nicht davon aus, dass unsere Nahrungsflächen den Sauerstoff erheblich abbauen (zumindest sollte der Sauerstoffmangel viel schwächer ausfallen als in anderen Studien). Einerseits wirft dieser Unterschied die Frage auf, ob unsere Ergebnisse auch in Situationen mit aktivem Sauerstoffmangel noch gelten würden, eine Frage, die wir experimentell nicht beantworten konnten, da es schwierig ist, die Dichte metabolisch aktiver Bakterien genau zu kontrollieren. Andererseits zeigen unsere Ergebnisse, dass C. elegans auch ohne die Hilfe von Sauerstoffreizen in der Lage ist, effizient nach Nahrung zu suchen.

Eine Einschränkung unserer Studie besteht darin, dass wir ein einzelnes experimentelles Ergebnis (Patchbelegung) gemessen haben. Unterschiede in diesem Ergebnis ergeben sich aus Veränderungen elementarer Verhaltensparameter wie Geschwindigkeit, Wendegeschwindigkeit, Wahrscheinlichkeit unterschiedlicher Verhaltenszustände (wie Roaming, Verweilen und Ruhe) usw.24,25,26,30. Eine genauere Untersuchung dieser Parameter könnte Unterschiede aufdecken, die hier nicht erkennbar waren. Dieser höhere Detaillierungsgrad war mit dem für die Offenlegung der Faustregel erforderlichen Durchsatz- und Abdeckungsniveau nicht möglich, ist aber ein natürlicher nächster Schritt zur Enthüllung ihrer mechanistischen und neuronalen Umsetzung.

Eine zweite Einschränkung unserer Studie besteht darin, dass unsere Sammlung von Bakterienstämmen zwar größer und vielfältiger ist als die in den meisten früheren Studien verwendeten, wir jedoch nicht in der Lage waren, die gesamte Vielfalt natürlicher Bakterien zu untersuchen. Aufgrund der experimentellen Einschränkungen waren wir insbesondere auf Bakterien beschränkt, die aerob auf LB-Medium wachsen. Außerdem erwiesen sich die meisten unserer Stämme als stäbchenförmig (zwei von ihnen bildeten Ketten oder Filamente; ergänzende Abbildung 11 und ergänzende Tabelle 2), sodass wir nicht wissen, ob unterschiedliche Formen die Reaktion von C. elegans verändern würden. Allerdings zeigten unsere Stämme eine große Variabilität bei vielen anderen Variablen: Sie decken sieben verschiedene Bakterienfamilien ab, weisen einen mehr als 30-fachen Volumenunterschied zwischen dem kleinsten und dem größten Stamm auf (Ergänzungstabelle 2) und umfassen sowohl grampositive als auch grampositive -negative Bakterien, Arten mit fakultativ anaerobem Wachstum, Unterschiede in der Nitratreduktion usw. (Ergänzungstabellen 3 und 4). Diese Variabilität reicht aus, um unsere wichtigsten Schlussfolgerungen zu untermauern: Die große Diversität in der Zellgröße zeigt, dass C. elegans stärker auf die Zellzahl reagiert als auf andere Methoden zur Messung der Bakteriendichte (z. B. Biomasse) und dass seine Reaktion unabhängig von anderen Merkmalen von ist die Bakterienstämme (Membranzusammensetzung, Art des Stoffwechsels etc.).

Eine dritte Einschränkung unserer Studie ist die Verwendung der Eiablage als Indikator für die Fitness. Fitness ist eine schwer fassbare Größe und es ist schwierig, sie direkt zu messen, da dafür langfristige Messungen über mehrere Generationen hinweg erforderlich sind47,48. Es können verschiedene Fitnessindikatoren verwendet werden, und in früheren Studien an C. elegans wurden die Anzahl der Nachkommen49,50, die Entwicklungsrate34,49, die Anzahl der Nachkommen, die das Erwachsenenalter erreichen49,51, die Lebenserwartung49 und andere52 herangezogen. Während längerfristige Messungen eher den tatsächlichen Entwicklungsverlauf der Population widerspiegeln, sind sie nur dann sinnvoll, wenn die Umwelt über einen ausreichend langen Zeitraum relevant und stabil bleibt. Dies war bei uns nicht der Fall, da unsere Fitnessexperimente mit einem einzigen Nahrungsfeld und nicht in einer natürlicheren Umgebung durchgeführt wurden. Diese Bedingungen zwangen uns, die Eiablage als kurzfristigen Indikator für die Fitness zu verwenden, mit der zusätzlichen Einschränkung, dass wir nicht auf das Schlüpfen der Eier warten konnten, was die Genauigkeit unserer Messungen weiter verringern könnte (siehe Methoden). Es ist jedoch anzumerken, dass die Faktoren, die die langfristige Fitness in einer naturalistischen Umgebung beeinflussen (z. B. zukünftige Verfügbarkeit von Nahrung, zukünftige Temperatur, Raubtiere usw.), ungewiss sind, während eine Person ein Nahrungsgebiet ausbeutet. Daher werden Futtersuchentscheidungen wahrscheinlich durch den unmittelbaren Nutzen der Nahrung für die Fähigkeit des Wurms, Nachkommen zu produzieren, bestimmt, was durch die in unserem Experiment gemessene Anzahl von Eiern gut widergespiegelt wird.

Eine vierte Einschränkung dieser Studie ist das fehlende Bakterienwachstum, das die Produktion bakterieller Metaboliten einschränkt. Diese Metaboliten sind wahrscheinlich unter natürlichen Bedingungen relevant, was sicherlich auch bei pathogenen Bakterien der Fall ist41,42. Unsere Versuchsbedingungen waren notwendig, um die Bakteriendichte richtig zu kontrollieren, und die gute Korrelation von Verhalten und Fitnessvorteil zeigt die ökologische Relevanz unserer Beobachtungen. Diese kontrollierten experimentellen Bedingungen haben einen zentralen Verhaltensmechanismus offenbart, der eine adaptive Reaktion hervorruft, indem er sich auf die aussagekräftigste Umgebungsvariable konzentriert.

Alle Experimente wurden mit Caenorhabditis elegans, Stamm N2, durchgeführt, der vom Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, https://cgc.umn.edu/) bezogen wurde, und unter Verwendung von Standardpraktiken53 durchgeführt. Würmer wuchsen bei 22 °C auf Nematoden-Wachstumsmedium (NGM: 3 g/L NaCl, 2,5 g/L Pepton, 20 g/L Agar, 25 ml/L Kaliumphosphatpuffer pH 6, 1 mM MgSO4, 5 mg/L Cholesterin). , 1 mM CaCl2), in Petrischalen mit 100 mm Durchmesser, die mit 200 μl einer gesättigten Kultur von E. coli OP50-Bakterien (über Nacht auf LB bei 22 °C gezüchtet) beimpft wurden. Um einen Nahrungsmangel zu verhindern, wurden die Würmer alle 1–3 Tage in eine frische Schale überführt, so dass die in jedem Experiment verwendeten Würmer aus einer Population stammten, die seit mindestens 5 Generationen keinen Nahrungsmangel mehr erlebt hatte. Um eine Anhäufung von Mutationen zu verhindern, haben wir sichergestellt, dass unsere Population nie mehr als 30 Generationen von den vom CGC erhaltenen Individuen entfernt war. Wir führten alle Experimente mit 48 Stunden alten Würmern durch, synchronisiert durch Bleichen und Eiersammeln (dh die Experimente wurden 48 Stunden nach der erneuten Fütterung der durch das Bleichverfahren erhaltenen L1-Larven durchgeführt).

Escherichia coli (OP50), Escherichia coli (Hb101), Escherichia coli (DA837), Serratia marcescens (Db10), Bacillus megaterium (DA1880) und Bacillus simplex (DA1885) wurden vom Caenorhabditis Genetics Center erhalten. Lysinibacillus boronitolerans (CR13), Bacillus flexus (CR87), Pseudomonas viridiflava (CR90), Ochrobactrum grignonense (CR155), Bacillus Safensis (CR164), Corynebacterium variabile (CR181), Rhodococcus Globerulus (CR266), Pseudomonas veronii (CR220) und Raoultella terrigena (CR225) wurden von uns aus dem Darm von C. elegans N2-Würmern isoliert, die sich von organischem Kompost ernährt hatten (siehe unten).

Bakterien wurden auf NGM-Platten aus einem Glycerinstamm bei –80 °C ausgestrichen, bei 4 °C gelagert und alle zwei Wochen erneut auf eine frische Platte ausgestrichen, um die Lebensfähigkeit sicherzustellen. Um Flüssigkulturen vorzubereiten, inokulierten wir eine oder zwei Bakterienkolonien in 5 ml LB-Medium und inkubierten 24 Stunden lang bei 22 °C und Orbitalschütteln bei 300 U/min in einem geschlossenen 50-ml-Falcon-Röhrchen. Dann wurde 1 μl dieser Kultur entweder in 5 oder 10 ml frisches LB geimpft und weitere 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen inkubiert. Eine Ausnahme bildete E. coli Hb101, da es länger als 24 Stunden dauerte, bis die Sättigung erreicht war. In diesem Fall haben wir die zweite Inokulation ausgelassen und die Inkubation der ursprünglichen Kultur insgesamt 48 Stunden lang fortgesetzt.

Die natürlichen Mikrobiota-Stämme von C. elegans wurden isoliert, indem C. elegans auf verschiedenen Arten von verrottetem organischem Material gezüchtet wurde. Anschließend wurden die Würmer außen gewaschen und sterilisiert, die Würmer zermahlen und die resultierende Bakteriensuspension auf Agarplatten ausplattiert.

Wir bereiteten zunächst hitzegetötete E. coli OP50 vor, indem wir OP50 24 Stunden lang in 200 ml tryptischer Sojabrühe (Teknova, Hollister, CA, USA) bei 37 °C wachsen ließen, anschließend abzentrifugierten und in 4 ml S-Medium resuspendierten (hergestellt wie beschrieben in53) und Inkubation bei 80°C für 24 Stunden. Dieses Verfahren führt zu 50x E. coli OP50 (50x im Vergleich zur Dichte bei Sättigung).

Den Würmern wurden zwei Arten von Nahrungsquellen verfüttert: verschiedene Arten von (i) Kompost und (ii) verdorbenem Obst und Gemüse. Einige faule Äpfel wurden direkt von außen eingesammelt. Andere Früchte wie Äpfel, Sellerie, Mandeln und Pastinaken wurden auf lokalem Boden aus Boston, MA, in einer Haushaltsplastikbox (Sterilite) mit halboffenem Deckel platziert und im Labor bei Raumtemperatur inkubiert, bis die Früchte stark verrottet waren (ca. 3 Wochen). ). Die Kompostproben wurden aus zwei örtlichen Komposthaufen in Boston, MA, entnommen, die hauptsächlich Küchen- und Gartenabfälle enthielten. Den Proben wurden einige Mengen phosphatgepufferter Kochsalzlösung und Glasperlen zugesetzt. Die Proben wurden durch Vortexen bei hoher Geschwindigkeit homogenisiert. Die resultierende Lösung wurde durch einen 5-µm-Filter (Millex-SV 5,0 µm, MerckMillipore, Darmstadt, Deutschland) filtriert, um größere Partikel zu entfernen. Die resultierende Emulsion wurde auf S-Medien-Agarplatten ohne Citrat ausgebreitet.

C. elegans N2 wurde zunächst auf E. coli OP50-Rasen auf NGM-Platten gezüchtet. Die Würmer wurden mit M9-Wurmpuffer mit 0,1 % Triton X-100 von den Platten abgewaschen. Die Würmer wurden etwa 1 Minute lang absinken gelassen und der Überstand wurde entfernt. Die Würmer wurden in S-Medium mit 100 µg/ml Gentamicin und 5x hitzegetötetem OP50 (5x im Vergleich zur Dichte bei Sättigung) resuspendiert. Die Würmer wurden in dieser Lösung 24 Stunden lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert (50-ml-Röhrchen, halb aufgeschraubter Deckel). Abschließend wurden die Würmer zweimal mit M9-Wurmpuffer + 0,1 % Triton X-100 gewaschen.

Die keimfreien Würmer wurden für etwa eine Woche auf die Platten mit verrottetem organischem Material gegeben. Danach wurden die Würmer mit M9-Wurmpuffer mit 0,1 % Triton X-100 von den Platten abgewaschen. Die Würmer wurden zweimal mit M9-Wurmpuffer mit 0,1 % Triton X-100 gewaschen (Zentrifugation bei 2000 g, 10 s). Anschließend wurden die Würmer in 1 ml eiskaltem M9-Wurmpuffer mit 0,1 % Triton X-100 resuspendiert und 10 Minuten auf Eis inkubiert. 2 µL Bleichmittel (Clorox) wurden hinzugefügt, um Bakterien an der Außenseite des Wurms abzutöten, und die Würmer wurden 6 Minuten lang auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Würmer 3x mit eiskaltem M9-Wurmpuffer mit 0,1 % Triton X-100 gewaschen. Einzelne Würmer wurden in 0,6-ml-Reaktionsröhrchen (Eppendorf) überführt und mit einem motorisierten Stößel (Kimble Kontes Pellet Pestle, Fisher Scientific) mindestens 1 Minute lang zermahlen. Die resultierende Lösung wurde auf eine Agarplatte mit tryptischer Sojabrühe (Teknova, Hollister, CA, USA) (2 % Agar, Petrischale mit 150 mm Durchmesser) ausplattiert. Aus den resultierenden Kolonien wurden physiologisch einzigartige Kolonien gepflückt. Die Kolonien wurden erneut auf tryptischem Sojabrühe-Agar ausgestrichen und auf Verunreinigungen überprüft. Wurden Verunreinigungen festgestellt, wurden die Bakterien erneut ausgestrichen. Schließlich wurden die Bakterien in tryptischer Sojabrühe bei 30 °C gezüchtet und als Glycerinvorräte gelagert. Die Artidentität wurde durch 16 S Sanger-Sequenzierung (Genewiz, South Plainfield, NJ) analysiert.

Die phylogenetische Identität wurde anhand der 16 S-rRNA-Gensequenz durch das dada254-Paket zugewiesen, das auf dem Green-Gen-16-S-Datensatz trainiert wurde55. Stämme sind auf Anfrage bei den Autoren erhältlich.

Die Tests wurden in Futterplatten (3 g/L NaCl, 20 g/L Agar, 25 ml/L Kaliumphosphatpuffer pH 6, 1 mM MgSO4, 5 mg/L Cholesterin, 1 mM CaCl2, 10 mg/L Chloramphenicol und 100 mg/L) durchgeführt mg/L Novobiocin). Die Zusammensetzung dieser Platten wurde entwickelt, um das Wachstum von Bakterien zu verhindern. Sie enthalten keine Nährstoffe für die Bakterien und enthalten zwei bakteriostatische Antibiotika. Wir haben uns für diesen Antibiotika-Cocktail entschieden, nachdem wir die minimale Hemmkonzentration (MIC) für 6 verschiedene bakteriostatische Antibiotika und alle unsere Bakterienstämme gemessen hatten. Unser Ziel war es, das Bakterienwachstum zu verhindern und gleichzeitig die Bakterien so gesund wie möglich zu halten, und wir kamen zu dem Schluss, dass 10 mg/L Chloramphenicol und 100 mg/L Novobiocin die beste Kombination sind, um das Wachstum aller Stämme zu verhindern und gleichzeitig die Antibiotikakonzentration so niedrig wie möglich zu halten . Wir überprüften, dass alle Bakterienstämme nach 24-stündiger Einwirkung dieses Antibiotika-Cocktails lebensfähig blieben und eine konstante optische Dichte aufwiesen. Die Platten wurden eine Woche vor den Tests gegossen und bei Raumtemperatur gelagert.

Einen Tag vor dem Experiment wurden die Bakterienkulturen dreimal mit Futterpuffer (3 g/L NaCl, 25 ml/L Kaliumphosphatpuffer pH 6, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 10 mg/L Chloramphenicol und 100 mg/L) gewaschen Novobiocin). Nach dem letzten Waschen suspendierten wir die Bakterien erneut in Futterpuffer und stellten ihre OD mit einem Spektrophotometer (Jenway 7200, Cole-Parmer, Staffordshire, UK) auf den für unser Experiment erforderlichen maximalen OD ein. Anschließend führten wir serielle Verdünnungen in Futterpuffer durch, um alle erforderlichen Dichten zu erhalten.

Ein Pipettierroboter (OT-2, Opentrons, Long Island City, NY, USA, mit kundenspezifischen Modifikationen zur Handhabung von Agarplatten) platzierte Tropfen der Bakterienkultur auf den Futterplatten. In allen Fällen verwendeten wir 40-μL-Tropfen, die sich auf einen Durchmesser von durchschnittlich 11,2 mm ausbreiteten. Die Tropfen wurden über Nacht bei 22 °C trocknen gelassen. Einige unserer Versuchsbedingungen enthielten ein Nahrungspflaster ohne Bakteriendichte. In diesen Fällen ließen wir einfach eine der Abwurfpositionen leer (wir haben dort nichts hineinpipettiert), zählten dann aber die Anzahl der Würmer in diesem Bereich, als ob dort ein Futterfleck wäre.

Wir verwendeten Nahrungsplatten mit 55 mm Durchmesser und fünf 40-μl-Bakterientropfen, die ein regelmäßiges Fünfeck bildeten, wobei die Fleckenmitte 13 mm von der Plattenmitte entfernt war. Für jede Versuchsbedingung (bestehend aus fünf verschiedenen Lebensmitteldichten) haben wir mindestens vier verschiedene Versionen vorbereitet und dabei die Position der fünf Dichten auf den fünf Lebensmittelfeldern zufällig verändert, um Auswirkungen aufgrund der relativen Position der Lebensmittelfelder zu minimieren. Anschließend erstellten wir mindestens 8 Replikate jeder Version, sodass wir insgesamt mindestens 32 Platten pro Zustand hatten. Wir haben auch die Reihenfolge, in der die verschiedenen Bedingungen vorbereitet wurden, randomisiert. Einen Tag vor dem Experiment wurden Lebensmittelpflaster auf die Versuchsplatten gelegt und über Nacht bei 22 °C getrocknet.

48 Stunden alte synchronisierte Würmer wurden mit M9-Wurmpuffer + 0,1 % Triton % Triton X-100; Triton X-100 wurde hinzugefügt, um zu verhindern, dass Würmer an den Pipettenspitzen haften bleiben. Um alle Bakterien zu entfernen, haben wir die resultierende Wurmsuspension sechsmal mit M9 + 0,1 % Triton Anschließend wurden vom Pipettierroboter Würmer in Tropfen von 10–15 μL in die Mitte der Versuchsplatten gegeben (angepasst an durchschnittlich 10 Würmer pro Platte). Der vollständige Waschvorgang dauerte zwischen 8 und 10 Minuten und das Platzieren der Würmer dauerte höchstens 5 Minuten, sodass zwischen der Zuchtplatte und der Versuchsplatte höchstens 15 Minuten vergingen.

Die Würmer wurden 2 Stunden lang bei 22 °C auf den Platten belassen, und dann haben wir die Platten mit einem Scanner (Epson Perfection V850 Pro) mit 1200 dpi bebildert. Frühere Protokolle, die ähnliche Scanner zur Quantifizierung des Wurmverhaltens verwenden, schlugen Modifikationen vor, um die Bildqualität zu erhöhen und die Temperatur zu kontrollieren56. Wir stellten jedoch fest, dass unmodifizierte Scanner eine ausreichend gute Bildqualität für unsere Zwecke lieferten und die Temperaturkontrolle für uns kein Problem darstellte, da die Platten am Ende des Experiments nur kurz auf die Scanner gelegt wurden. Beim Platzieren der Platten auf den Scannern ist äußerste Vorsicht geboten, da schon ein sanfter Schlag die Würmer erschrecken und sie dazu bringen kann, die Nahrungsflächen zu verlassen. Würmer wurden mithilfe eines maßgeschneiderten, in Matlab R2019a erstellten Programms automatisch in den Bildern lokalisiert.

Unser Ziel war es, 32 Platten für jede Versuchsbedingung (8 Platten für jede Version mit permutierten Positionen) mit 10 Würmern pro Platte zu haben. Allerdings war die tatsächliche Anzahl an Platten und Würmern geringer. Zuerst haben wir einen kleinen Teil der Platten entfernt, die Unvollkommenheiten auf der Agaroberfläche oder unrunde Lebensmittelflecken aufwiesen. Da wir zweitens nicht die genaue Anzahl der Würmer auf jeder Versuchsplatte kontrollieren konnten (nur das Volumen und die Konzentration der Wurmsuspension), hatten wir erhebliche Schwankungen in der Anzahl der Würmer pro Platte. Um signifikante Auswirkungen durch Nahrungsmangel zu verhindern, haben wir alle Platten, auf denen sich mehr als 20 Würmer befanden, aus der Analyse entfernt. Nach dieser Filterung hatten wir 29 ± 4 Platten pro Bedingung und 230 ± 110 Würmer pro Bedingung (Mittelwert ± Standardabweichung). Die vollständigen Stichprobengrößen finden Sie in der Ergänzungstabelle 1. Dann addierten wir für jede Versuchsbedingung alle Würmer, die an Stellen mit einer bestimmten Dichte gefunden wurden (über alle Replikate hinweg), und fügten eine Pseudozählung hinzu, um eine weniger verzerrte Schätzung zu erhalten57.

Wir gehen davon aus, dass die Anzahl der Würmer, die in einem bestimmten Nahrungsgebiet gefunden werden, proportional zu seiner Attraktivität \(A\) ist, die wir als definieren

Dabei ist \(H\) das Verhältnis zwischen seinem höchsten und niedrigsten Punkt, \(k\) die Steigung am Mittelpunkt des Sigmoids (in einem doppelt logarithmischen Diagramm) und \({D}_{{{\mbox{ anziehen}}}}\) ist die Dichte, bei der die relative Anzahl der Würmer das Fünffache der Basislinie niedriger Dichte erreicht (Abb. 1c; die Basislinie niedriger Dichte ist \(A\left(D=0\right)= 1/\sqrt{H}\) und \(A\left(D={D}_{{{\mbox{attract}}}}\right)=5\sqrt{H}/\left(H+ 4\right)\ungefähr 5/\sqrt{H}\) wenn \(H\gg 1\)).

Dann beträgt der Anteil der Würmer, die in jedem Nahrungsfeld auf einem bestimmten Teller vorhanden sind

wobei \({P}_{i}\) der Anteil der Würmer im \(i\)-ten Nahrungsfeld ist, \({A}_{i}\) die Attraktivität des \(i\) -tes Nahrungsbeet und \(M\) ist die Anzahl der im Experiment vorhandenen Beete. Gleichung 2 ist eine starke Annahme, die in unserem System aus Gründen, die in einem separaten Artikel untersucht werden, annähernd gilt und durch die hervorragende Anpassungsgüte unseres Modells bestätigt wird (Abb. 1e).

Um die Parameter des Modells an unsere experimentellen Daten anzupassen, maximieren wir die Log-Likelihood des Modells. Für eine Versuchsplatte beträgt die Log-Likelihood

Dabei ist \({N}_{i}\) die Anzahl der im \(i\)-ten Patch gefundenen Würmer, \(M\) die Anzahl der Patches (in allen unseren Experimenten) und \({ P}_{i}\) wird mithilfe der Gleichungen berechnet. 1 und 2. Wenn wir dann mehrere Platten haben, deren Ergebnisse durch dasselbe Sigmoid beschrieben werden müssen, berechnen wir die gesamte Log-Likelihood als \({L}_{{{\mbox{total}}}}={\sum }_{k=1}^{K}{L}_{k},\) wobei \({L}_{k}\) die Log-Likelihood der k-ten Platte ist (berechnet mit Gleichung 3). ) und \(K\) ist die Anzahl der Platten. Beachten Sie, dass die Bedingungen auf den Tellern nicht identisch sein müssen (z. B. können auf jedem Teller Lebensmittelflecken unterschiedlicher Dichte vorhanden sein).

Anschließend haben wir mithilfe der Funktion „fmincon“ von Matlab (Matlab R2019a) den Parametersatz gefunden, der \({L}_{{{\mbox{total}}}}\) maximiert. Sobald die optimalen Parameter gefunden sind, werden die Gleichungen verwendet. 1 und 2 liefern eine gute Beschreibung für den Anteil der Würmer, die jeden Fleck in jedem einzelnen Experiment erreichen (ergänzende Abbildung 2A).

Diese beiden Gleichungen werden auch verwendet, um alle Diagramme darzustellen, die vorhergesagte gegenüber experimentellen Ergebnissen zeigen (ergänzende Abbildung 2b), wie in den Abbildungen dargestellt. 1e, 1g, 3d des Haupttextes.

Um die experimentellen Daten aus Experimenten, die unterschiedliche Dichtebereiche für denselben Bakterienstamm abdecken (die drei Spalten in der ergänzenden Abbildung 2), zusammen darzustellen, haben wir die Daten neu normalisiert und eine relative Anzahl von Würmern berechnet, \({N }_{i}/{N}_{{{\mbox{ref}}}}\) (wobei \({N}_{i}\) die Anzahl der Würmer im \(i\)-ten ist Nahrungsbeet und \({N}_{{{\mbox{ref}}}}\) ist die Anzahl der Würmer in einem Referenzbeet). Diese Normalisierung wäre trivial, wenn wir in jedem Experiment ein Referenz-Nahrungsmittelfeld mit einer gemeinsamen Dichte hätten, aber das wäre in der Praxis nicht möglich: Unser Dichtebereich ist sehr breit und die Unterschiede in der Belegung des Feldes erstrecken sich über mehr als zwei Größenordnungen. Wenn Nahrungsfelder mit sehr unterschiedlicher Dichte auf demselben Teller platziert werden, sammeln sich Würmer in den Bereichen mit hoher Dichte an, sodass die Bereiche mit niedriger Dichte fast vollständig leer bleiben, was zu sehr verrauschten Datensätzen führt. Aus diesem Grund deckte jedes einzelne Experiment einen relativ kleinen Dichtebereich ab (ergänzende Abbildung 2a). Obwohl sich benachbarte Bereiche mit mindestens zwei Datenpunkten überlappen, war daher nicht in allen eine einheitliche Dichte vorhanden.

Um dieses Problem zu umgehen und alle Daten zusammen darstellen zu können, haben wir unsere Sigmoidalanpassung verwendet, um die Anzahl der Würmer zu schätzen, die wir in einem virtuellen Referenzfeld erwarten würden, und diese Schätzung verwendet, um unsere experimentellen Daten erneut zu normalisieren. Das Verfahren funktioniert wie folgt: Betrachten Sie \(C\) verschiedene Bedingungen, die durch dasselbe Sigmoid beschrieben werden müssen (z. B. die drei Bedingungen, die unterschiedliche Dichtebereiche abdecken und in der ergänzenden Abbildung 2 mit unterschiedlichen Farben dargestellt sind). Sei \({M}_{c}\) die Anzahl der Patches in der \(c\)-ten Bedingung und \({A}_{c,i}\) die Attraktivität der \(i\) -ter Patch der \(c\)-ten Bedingung. Sei \({N}_{c,i}\) die Gesamtzahl der Würmer auf dem \(i\)-ten Feld der \(c\)-ten Bedingung (aggregiert über alle Platten mit der gleichen Bedingung, wie beschrieben am Ende des Abschnitts „Patch-Belegungstests“). Wir haben unseren virtuellen Referenz-Patch so gewählt, dass er sich in der Mitte des Sigmoids befindet, und für die \(c\)-te Bedingung hätte dieser virtuelle Patch die folgende Anzahl von Würmern:

Dann zeichnen wir für jedes Nahrungsgebiet und jede Bedingung die relative Anzahl der Würmer (\({N}_{c,i}/{N}_{c,{{\mbox{ref}}}}\) für die auf \(i\)-ter Patch der \(c\)-ten Bedingung). Durch dieses Verfahren werden die experimentellen Daten aus verschiedenen Experimenten neu ausgerichtet (ergänzende Abbildung 2c), sodass wir sie in einem einzigen Diagramm darstellen können (ergänzende Abbildung 2d). Diese Ausrichtung hängt jedoch von der Passform selbst ab und bietet daher keinen zuverlässigen visuellen Hinweis auf die Güte der Passform. Dieser visuelle Hinweis auf die Güte der Anpassung findet sich in den Diagrammen, die vorhergesagte gegenüber experimentellen Ergebnissen zeigen, die von dieser Normalisierung nicht betroffen sind (Abb. 1e, 1g, 3d und ergänzende Abb. 2b).

Wir verwendeten 35-mm-Futterplatten mit einem 40-μL-Bakterientropfen in der Mitte, platzierten sie am Tag vor dem Experiment auf der Platte und trockneten sie bei 22 °C. 48 Stunden alte Würmer wurden auf die gleiche Weise wie für Patch-Occupancy-Tests von ihren Brutplatten gewaschen. Anschließend wurden einzelne Würmer mit einer Pipette gefischt und auf dem Bakterienpflaster platziert (ein Wurm pro Platte). Anschließend wurde ein Kupferring mit einem Durchmesser von 2 cm um das Pflaster herum in den Agar gelegt, um den Wurm am Entweichen zu hindern. Die Würmer wurden 5 Stunden lang auf dem Rasen belassen und dann 5 Minuten lang einer Temperatur von –20 °C ausgesetzt. Dieser kurze Zeitraum gewährleistete eine schnelle Kühlung der Platten, um die Würmer zu immobilisieren und die Eiablage zu stoppen, ohne dass das Agar einfrierte. Anschließend wurden die Platten bei 4 °C gelagert. Die Würmer blieben unbeweglich und es schlüpften keine Eier, sodass die Eier noch mindestens zwei Wochen nach dem Experiment gezählt werden konnten. Die Eier wurden manuell gezählt, wobei alle Platten ausgeschlossen wurden, auf denen versehentlich mehr als ein Wurm platziert wurde oder bei denen der Wurm den durch den Kupferring begrenzten Bereich verlassen hatte. Alle Experimente wurden am selben Tag durchgeführt, um die experimentelle Variabilität zu minimieren, die Eier wurden jedoch in den zwei Wochen nach dem Experiment gezählt. Aufgrund experimenteller Komplikationen konnten wir die Fitness von C. elegans an B. flexus (CR87) nicht messen, sodass wir Messungen für 11 unserer 12 Stämme haben. Stichprobengrößen finden Sie in der Ergänzungstabelle 1.

Aufgrund experimenteller Einschränkungen haben wir nicht geschlüpfte Eier gezählt (anstatt darauf zu warten, dass sie schlüpfen, was auch die Lebensfähigkeit berücksichtigen würde). Unser Experiment erforderte mehr als 1500 Platten, daher wäre es unpraktisch gewesen, jedes erwachsene Tier nach 5 Stunden manuell zu entfernen, um den Eiern mehr Zeit zum Schlüpfen zu geben. Außerdem konnte der Kupferring das Entweichen der Würmer nicht zu 100 % verhindern. Während es leicht war, alle Fälle zu verwerfen, in denen das erwachsene Tier entkommen war, hätten fehlende Larven die Genauigkeit unserer Messungen beeinträchtigt.

Eine weitere experimentelle Einschränkung ergab sich aus dem Alter der Würmer: Unsere Verhaltensexperimente wurden mit 48 Stunden alten Würmern durchgeführt, und Fitnessexperimente mussten im gleichen Alter durchgeführt werden. Zu diesem Zeitpunkt fangen die Würmer jedoch gerade erst an, fruchtbar zu sein, und es kann sein, dass einige Individuen zu Beginn unseres Fitnessexperiments noch nicht mit der Eiablage begonnen hatten. Dieser Faktor verringert wahrscheinlich die Genauigkeit unserer Fitnessmessungen, ändert jedoch nichts an unseren Schlussfolgerungen. Wir haben die Reihenfolge, in der Würmer zu jeder Versuchsbedingung hinzugefügt wurden, gründlich randomisiert, sodass Alterseffekte keine systematische Verzerrung hervorrufen sollten. Außerdem verfügen alle unsere Ergebnisse über 95 %-Konfidenzintervalle, die per Bootstrapping berechnet wurden und diese experimentelle Variabilität berücksichtigen.

Um \({D}_{{{\mbox{fitness}}}}\) zu bestimmen, haben wir zunächst die höchste Dichte ermittelt, bei der die durchschnittliche Anzahl der Eier unter dem Schwellenwert lag. Dann führten wir eine lineare Interpolation zwischen diesem und dem nächsten Punkt durch, mit Bakteriendichten im logarithmischen Maßstab.

Die optische Dichte (OD) wurde mit einem Spektrophotometer (Jenway 7200, Cole-Parmer, Staffordshire, UK) gemessen. Wir haben herausgefunden, dass dieses Spektrophotometer für ODs zwischen 0,1 und 1 am genauesten ist. Deshalb haben wir die Bakterienkulturen immer verdünnt, um Messungen in diesem Bereich zu erhalten. Niedrigere ODs konnten nicht genau gemessen werden, daher werden sie aus den Verdünnungsfaktoren abgeleitet, die zu ihrer Herstellung verwendet wurden.

Um die Dichte in Zellen pro Mikroliter zu bestimmen, kombinierten wir das Ausplattieren zur Bestimmung der Menge an koloniebildenden Einheiten (KBE) mit der Mikroskopie, um die Beschaffenheit jeder KBE zu untersuchen.

Wir haben die KBE-Dichte wie folgt bestimmt. Nach der Bestimmung der OD der Bakterienkultur führten wir 10-fache Reihenverdünnungen in M9-Wurmpuffer (3 g/L KH2PO4, 7,52 g/L Na2HPO4.2H2O, 5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4) durch und plattierten vier 10 -Mikroliter-Tropfen jeder Verdünnung auf eine NGM-Platte geben. Wir haben diese Platte 48 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, die Anzahl der Kolonien in den Tropfen gezählt, die etwa 10 Kolonien enthielten, und diese Zählungen verwendet, um die Dichte der koloniebildenden Einheiten in unserer ursprünglichen Kultur abzuleiten. Wir haben die Fehlerbalken berechnet, indem wir die vier Tropfen für jede Messung gebootet haben. Wir haben dieses Plattierungsverfahren sowohl vor als auch nach dem Waschen der Bakterien mit Nahrungspuffer durchgeführt, um unsere Versuchsplatten vorzubereiten (siehe „Vorbereitung der Versuchsplatten“), und wir konnten vor und nach dem Waschen keine konsistenten Unterschiede feststellen.

Die Anzahl der KBE/μL ist nicht identisch mit der Anzahl der Zellen/μL. Erstens überleben nicht alle Zellen, die auf die Oberfläche einer Agarplatte fallen, und schaffen es, eine Kolonie zu bilden. Um diesen Effekt zu kontrollieren, führten wir eine Kontrolle mit LB-Platten anstelle von NGM-Platten durch und fanden keine signifikanten Unterschiede in der Lebensfähigkeit zwischen diesen beiden Plattentypen, was darauf hindeutet, dass die Lebensfähigkeit für alle Stämme in beiden Medien hoch war. Zweitens kann jede KBE eine einzelne Zelle sein, es kann sich aber auch um eine Ansammlung von Zellen handeln, die zusammenklumpen und eine einzelne Kolonie bilden. Um diesen Effekt zu kontrollieren, haben wir unsere Bakterienkulturen unter einem Mikroskop (LEICA DM6000) untersucht. Wir fanden heraus, dass 10 unserer 12 Bakterienstämme größtenteils aus einzelnen Zellen mit wenigen Klumpen bestanden, sodass für diese 10 Stämme CFU/μL ein guter Schätzwert für Zellen/μL ist. Im Gegensatz dazu bilden B. megaterium (DA1880) und B. flexus (CR87) lange Filamente, die aus mehreren Zellen bestehen, und jedes dieser Filamente bildet eine einzelne Kolonie. Mithilfe der DAPI-Färbung zur Visualisierung einzelner Zellen in jedem Filament haben wir die Anzahl der einzelnen Zellen pro Filament gezählt und durchschnittlich 9,6 bzw. 8,7 Zellen pro Filament für B. megaterium (DA1880) bzw. B. flexus (CR87) erhalten. Wir haben diese Faktoren verwendet, um die aus der Ausplattierung ermittelten KBE/μL für diese beiden Stämme in Zellen/μL umzuwandeln.

Um die Menge an Biomasse in unseren Bakterienkulturen zu bestimmen, haben wir 200 ml einer gesättigten Kultur für alle Stämme hergestellt, diese dreimal mit M9-Wurmpuffer gewaschen und auf ein Volumen von 5 ml resuspendiert. Anschließend haben wir den Außendurchmesser dieser Suspensionen gemessen und sie in Glasröhrchen gegeben, die wir zuvor gewogen hatten. Wir haben außerdem drei Röhrchen mit M9-Wurmpuffer ohne Bakterien hinzugefügt, um das Gewicht der im Puffer enthaltenen Salze berücksichtigen zu können. Wir verdampften das gesamte Wasser, indem wir die Röhrchen 24 Stunden lang bei 90 °C inkubierten und sie erneut wogen. Wir haben überprüft, dass eine längere Inkubation das Gewicht nicht veränderte, was bedeutete, dass 24 Stunden ausreichten, um das gesamte Wasser zu verdampfen. Anschließend berechneten wir die in jedem Röhrchen enthaltene Biomasse, indem wir das Gewicht nach der Inkubation abzüglich des Gewichts des leeren Röhrchens und abzüglich des Gewichts entsprechend den Salzen aus dem M9-Puffer abzogen (um dieses Gewicht zu berechnen, folgten wir dem gleichen Verfahren mit Röhrchen, die nur enthielten). M9-Puffer, was ein Trockengewicht von 15 g/L ergibt, was nahe am theoretischen Gewicht liegt, das wir aus der Rezeptur des M9-Wurmpuffers berechnen können. Siehe detailliertes Protokoll unter dx.https://doi.org/10.17504/protocols.io.kxygxzn44v8j/v1. Um Konfidenzintervalle zu berechnen, gingen wir davon aus, dass alle Gewichtsmessungen den gleichen proportionalen Fehler aufwiesen, der bei den drei Messungen zur Schätzung des Gewichts von M9-Salzen beobachtet wurde. Wir schätzten den Fehler bei OD-Messungen, indem wir 10 Messungen derselben Kultur durchführten, und kombinierten diese Zwei Fehlerquellen bei der Verwendung von Bootstrap.

Bakterien wurden aus Kolonien in 5 ml LB auf einem Schüttler bei 300 U/min und 22,5 °C 20–28 Stunden lang kultiviert. Anschließend wurden sie in M9 + 0,5 % Triton gewaschen, 5–10 Minuten in DAPI (1:2 bis 1:10 Verdünnung in M9 aus 1 mg/ml Stammlösung) inkubiert, einmal gewaschen und dann in M9 resuspendiert. Ein Mikroliter jeder Kultur wurde dann mit einem optischen Mikroskop LEICA DM6000 mit 40- bis 100-facher Vergrößerung auf Agarose 1 %-Pads abgebildet (siehe vollständiges Protokoll unter dx.https://doi.org/10.17504/protocols.io.n92ldpjr8l5b/v1).

Wir haben alle Fehlerbalken mit Bootstrap58 berechnet: Für eine gegebene Versuchsbedingung, für die wir P Replikate (d. h. P Versuchsplatten) haben, haben wir P dieser Replikate zufällig ausgewählt, mit Ersatz (so dass einige Replikate mehrmals ausgewählt werden können, andere nicht). gewählt). Indem wir dies unter allen unseren experimentellen Bedingungen durchführten, erhielten wir einen Bootstrapping-Datensatz. Wir haben somit mindestens 1000 Bootstrapping-Datensätze generiert. Diese Bootstrapping-Datensätze sind eine Schätzung dessen, was wir erwarten sollten, wenn wir unseren gesamten experimentellen Prozess 1000 Mal wiederholen würden, sodass sie eine Schätzung der Reproduzierbarkeit unserer Ergebnisse liefern58. Für jeden im Artikel gezeigten Fehlerbalken haben wir die entsprechende Menge für jeden der gebootstrappten Datensätze berechnet, die extremsten 2,5 % der Werte auf jeder Seite entfernt und das verbleibende Intervall als Fehlerbalken angegeben. Beispielsweise wurden Fehlerbalken in \({D}_{{{\mbox{attract}}}}\) berechnet, indem unser Sigmoid an jeden der Bootstrapping-Datensätze angepasst wurde, wobei die extremsten 2,5 %-Werte von \({D}_{ {{\mbox{attract}}}}\), die sich aus diesen Anpassungen ergeben, und meldet das verbleibende Intervall.

Die Signifikanz der Korrelationen wurde durch Anpassen linearer Regressionsmodelle unter Verwendung der Fitlm-Funktion von Matlab bewertet (Matlab 2019a).

Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse bei Messungen in verschiedenen Labors ist in der ergänzenden Abbildung 4 dargestellt.

Betrachten Sie Mischungen aus zwei Stämmen, A und B, und sei \({N}_{{{\mbox{A}}}}\, \({N}_{{{\mbox{B}}}}\ ) sei die Anzahl der Würmer, die experimentell in den beiden Beeten mit reinen Bakterienkulturen gefunden wurden. Für jede andere Mischung berechnet es das gewichtete arithmetische Mittel als \({{P}_{A}N}_{{{\mbox{A}}}}+{(1-{P}_{A})N }_{{{\mbox{B}}}}\) und das gewichtete geometrische Mittel als \({N}_{A}^{{P}_{A}}{N}_{B}^{ \left(1-{P}_{A}\right)}\), wobei \({P}_{A}\) der Anteil von Stamm A in der Mischung ist.

Das auf der Sigmoidalregel basierende Modell geht davon aus, dass die Reaktion auf beide Belastungen demselben Sigmoid folgt, mit \(H=146\), \(k=1,4\) und mit unterschiedlichen Anziehungsdichten für jede Belastung, \({D}_ {{{\mbox{attract}}},{{\mbox{A}}}}\) und \({D}_{{{\mbox{attract}}},{{\mbox{B}}} }\). Wenn also \({D}_{{{\mbox{A}}}}\) und \({D}_{{{\mbox{B}}}}\) die optischen Dichten beider reiner Stämme sind (In allen unseren Experimenten \({D}_{{{\mbox{A}}}}={D}_{{{\mbox{B}}}}=0,5\)) sind ihre effektiven Dichten \( {{D}_{{{\mbox{A}}}}/D}_{{{\mbox{attract}}},{{\mbox{A}}}}\) und \({{D} _{{{\mbox{B}}}}/D}_{{{\mbox{attract}}},{{\mbox{B}}}}\). Die effektive Dichte einer Mischung mit einem Anteil \({P}_{A}\) von Dehnung A und \((1-{P}_{A})\) von Dehnung B beträgt \({{{P }_{A}D}_{{{\mbox{A}}}}/D}_{{{\mbox{attract}}},{{\mbox{A}}}}+(1-{P }_{A}){{D}_{{{\mbox{B}}}}/D}_{{{\mbox{attract}}},{{\mbox{B}}}}\). Unter Verwendung dieser effektiven Dichte und der Gl. 1 und 2 finden wir den vorhergesagten Anteil an Würmern in jedem Nahrungsbeet. Die Multiplikation dieser Anteile mit der Gesamtzahl der Würmer ergibt die Anzahl der Würmer in jedem Nahrungsbeet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie verwendeten Daten sowie der Computercode, der zur Durchführung aller Analysen und zur Generierung aller Zahlen (mit Ausnahme der ergänzenden Abbildungen 1 und 11) erforderlich ist, finden Sie in den ergänzenden Daten 1.

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Einige Stämme wurden vom CGC bereitgestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. Wir danken Nic Vega für die Schulung zu C. elegans-Techniken, Céline Reyes für die Schulung und Hilfe bei der Mikroskopie, Anna Mattout für die Schulung und Hilfe bei der DAPI-Färbung, Tommaso Biancalani, Jonathan Friedman und anderen Mitgliedern von Jeff Gores Labor für aufschlussreiche Diskussionen und Mitglieder des IVEP-Teams am CRCA für Kommentare zum Manuskript. AAA erhielt Mittel von der SEVAB-Doktorandenschule an der Université Paul Sabatier, Toulouse, Frankreich. CR erhielt Fördermittel vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union (Fördervereinbarung Nr. 948753), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) – 468972576 und dem Exzellenzcluster EXC 2124 „Controlling Microbes to Infektionen bekämpfen“ (CMFI). JG erhielt Fördermittel von den National Institutes of Health (P40 OD010440) und der Schmidt Family Foundation. APE erhielt Mittel aus dem Human Frontier Science Program (LT000537/2015), einem CNRS Momentum-Stipendium, einem Forschungsstipendium der Fyssen Foundation, einem Start-up-Stipendium der Gore Family Foundation und dem Stipendium ANR-22-CE02-0002 (ForAnInstant) von der Agence Nationale de la Recherche (ANR).

Die folgenden Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Gabriel Madirolas, Alid Al-Asmar.

Zentrum für Forschung zur Tierkognition (UMR5169), Zentrum für Integrative Biologie, Universität Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse, 31062, Frankreich

Gabriel Madirolas, Alid Al-Asmar, Lydia Gaouar, Leslie Marie-Louise, Andrea Garza-Enríquez, Valentina Rodríguez-Rada und Alfonso Pérez-Escudero

Gruppe „Physik lebender Systeme“, Fachbereich Physik, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Mikail Khona, Martina Dal Bello, Christoph Ratzke, Jeff Gore und Alfonso Perez-Escudero

Interfakultäres Institut für Mikrobiologie und Infektionsmedizin Tübingen (IMIT), Exzellenzcluster EXC 2124 „Controlling Microbes to Fight Infections“ (CMFI), Universität Tübingen, Calwerstraße 7/1, 72076, Tübingen, Deutschland

Christoph Ratzke

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Konzeptualisierung: GM, JG, APE. Datenkuration: AAA, GM, APE. Formale Analyse: AAA, GM, APE. Finanzierungseinwerbung: AAA, JG, APE. Untersuchung: GM, AAA, LG, LML, AGE, VRR, MK, MDB, CR, APE. Methodik: GM, CR, APE. Projektverwaltung: JG, APE. Ressourcen: CR, APE. Software: APE. Aufsicht: GM, MDB, JG, APE. Validierung: AAA, APE. Visualisierung: AAA, APE. Schreiben – Originalentwurf: APE. Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten: AAA, GM, CR, JG, APE.

Korrespondenz mit Alfonso Pérez-Escudero.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Quan-Xing Liu und George Inglis. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Madirolas, G., Al-Asmar, A., Gaouar, L. et al. Die Nahrungssuche von Caenorhabditis elegans folgt einer einfachen Faustregel. Commun Biol 6, 841 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05220-3

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Eingegangen: 04. August 2022

Angenommen: 04. August 2023

Veröffentlicht: 14. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05220-3

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