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Mar 04, 2024

Ein Mikronadel-Impfstoffdrucker für thermostabiles COVID

Nature Biotechnology (2023) Diesen Artikel zitieren Die dezentrale Herstellung thermostabiler mRNA-Impfstoffe im Mikronadelpflaster-Format (MNP) könnte den Zugang zu Impfstoffen in ressourcenarmen Gemeinden verbessern

Nature Biotechnology (2023)Diesen Artikel zitieren

Die dezentrale Herstellung thermostabiler mRNA-Impfstoffe im Mikronadelpflaster-Format (MNP) könnte den Zugang zu Impfstoffen in ressourcenarmen Gemeinden verbessern, indem die Notwendigkeit einer Kühlkette und geschulten Gesundheitspersonals entfällt. Hier beschreiben wir einen automatisierten Prozess zum Drucken von mRNA-Impfstoffen gegen die MNP-Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) in einem eigenständigen Gerät. Die Impfstofftinte besteht aus mit mRNA beladenen Lipid-Nanopartikeln und einer löslichen Polymermischung, die durch In-vitro-Screening von Formulierungen für eine hohe Bioaktivität optimiert wurde. Wir zeigen, dass die resultierenden MNPs bei Raumtemperatur mindestens 6 Monate lang lagerstabil sind, wenn sie anhand eines Modell-mRNA-Konstrukts beurteilt werden. Die Effizienz der Impfstoffbeladung und die Auflösung von Mikronadeln legen nahe, dass mit einem einzigen Pflaster wirksame Dosen von in Lipid-Nanopartikeln eingekapselter mRNA im Mikrogramm-Maßstab verabreicht werden könnten. Immunisierungen bei Mäusen unter Verwendung manuell hergestellter MNPs mit mRNA, die für die Spike-Protein-Rezeptor-Bindungsdomäne des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) kodiert, stimulieren langfristige Immunreaktionen, die denen einer intramuskulären Verabreichung ähneln.

Ungeimpfte Gemeinschaften in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen sind einem hohen Risiko für wiederholte Ausbrüche der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) und anderer Infektionskrankheiten1 ausgesetzt, die die Sterblichkeit erhöhen, die Entstehung gefährlicherer Varianten fördern und sich negativ auf die Wirtschaft auswirken2. Massenimpfungen in diesen Gemeinden wurden durch Probleme wie eine unzureichende Kühlketten-kompatible Lager- und Transportinfrastruktur und eine unzureichende Anzahl von Gesundheitspersonal behindert3,4. Verteilte, lokale Systeme zur Herstellung geeigneter Impfstoffe bieten eine mögliche Lösung. Ein vielversprechendes Impfstoffformat in diesen Regionen sind thermostabile Mikronadelpflaster (MNPs)5,6,7,8. MNPs können selbst angewendet werden, sind weniger schmerzhaft als intramuskuläre (IM) Injektionen, erzeugen keinen Abfall durch scharfe Gegenstände, können so formuliert werden, dass sie über Monate haltbar bleiben, und wurden mit mehreren Arten von Impfstoffen verwendet, darunter verschiedene Nukleinsäuren9,10,11, 12,13,14. Im Zusammenhang mit COVID-19 haben sich mit Lipid-Nanopartikeln (LNP) verkapselte mRNA-Impfstoffe, wie sie von Moderna und Pfizer-BioNTech hergestellt werden, als äußerst wirksam bei der Vorbeugung schwerer Erkrankungen erwiesen. Nach unserem Kenntnisstand wurde bisher nicht über die intradermale (ID) Verabreichung eines mRNA-Impfstoffs in einem LNP-Vehikel unter Verwendung eines MNP mit langfristiger Thermostabilität berichtet.

Die Herstellung von MNPs bringt neue Herausforderungen in Bezug auf Herstellung, Beladung und Skalierbarkeit mit sich, die ihre Entwicklung verlangsamt haben, obwohl sie sich ideal für den Einsatz in Gebieten mit geringen Ressourcen eignen15,16,17,18. Für eine genaue Dosierung und eine ausreichende Hautpenetration müssen Mikronadeln scharf und von Charge zu Charge gleichbleibend groß sein19. MNPs sind durch das geringe Volumen, das für die Impfstoffbeladung zur Verfügung steht, begrenzt, insbesondere wenn Hilfsstoffe zur Stabilisierung labiler Antigene erforderlich sind20. MNPs werden in der Regel individuell mit arbeitsintensiven, manuellen und ungenauen Schritten wie Zentrifugieren handgefertigt, was eine konsistente, automatisierte Herstellung mit diesen Methoden zu einer Herausforderung macht21.

Hier beschreiben wir einen Mikronadel-Impfstoffdrucker (MVP) zur Herstellung auflösbarer MNPs, die mit LNP-eingekapselten mRNA-Impfstoffen oder anderen Ladungen beladen sind (Abb. 1a–c). Die Integration eines Mikronadel-Herstellungsprozesses in ein eigenständiges, modulares Gerät stellt besondere Herausforderungen dar. Die Mikronadelbildung, die typischerweise durch Formen22, Tröpfchenherstellung23, Tintenstrahldruck24,25 oder 3D-Druck26,27,28 erreicht wird, muss Mikronadeln mit scharfen, genauen und mikrometergroßen Merkmalen erzeugen. Die Formfüllung muss durch einen wiederholbaren Prozess gesteuert werden, der Abfall minimiert, bewegliche Teile reduziert, keine Benutzerinteraktion erfordert und in einen automatisierbaren maschinengesteuerten Arbeitsablauf integriert werden kann. Bei jedem Durchlauf spendet der MVP Impfstofftinte, füllt Mikronadelformen, ohne die Tinte zu stören, indem er Vakuum verwendet, um Luft aus der Form zu entfernen, und beschleunigt das Trocknen mithilfe eines automatisierten Arbeitsablaufs mit minimalem menschlichen Eingriff. Der automatisierte Arbeitsablauf integriert einen hochpräzisen Roboterspender, eine programmierbare Vakuumkammer und modulare Bewegungstische mit wiederverwendbaren Mikronadelformen. Der im Gerät verwendete Prozess basiert auf der Vakuumanwendung, ist mit einer Vielzahl von MNP-Designs kompatibel und für die Minimierung von Impfstoffabfällen optimiert.

a: Modulare Tinten, die mRNA, Lipide und Polymer enthalten, können für den Mikronadel-Impfstoffdruck angepasst werden. b,c, Das MVP (b) kann in abgelegene Gebiete verteilt werden, um lokale Produktionskapazitäten (c) für thermostabile MNPs bereitzustellen. d, Nach der automatischen Abgabe wird durch PDMS Vakuum angelegt, um die Polymer-Impfstoff-Lösung in die Mikronadelform zu laden. Anschließend werden die Formen zur beschleunigten Trocknung in eine Trocknungsstation überführt. e: Die zum Laden der Polymer-Impfstofflösung in die PDMS-Form benötigte Zeit wurde für verschiedene Design- und Prozessparameter gemessen. Für alle Vergleiche wurden ungepaarte zweiseitige t-Tests verwendet, mit Ausnahme des Polymertyps, bei dem eine gewöhnliche einfaktorielle ANOVA verwendet wurde (n = 3 unabhängige Proben). f, Trocknungsgeschwindigkeit für verschiedene Trocknungsstrategien. ANCOVA wurde verwendet, um Schätzungen der Trocknungsgeschwindigkeit zu vergleichen, die aus einer linearen Regression der Trocknungsgeschwindigkeitsdaten (n = 3 unabhängige Proben) abgeleitet wurden. g: Die gesamte Tropfenfläche (n = 3 unabhängige Proben) und die Patch-Abdeckung (n = 100 unabhängige Proben) sind eine Funktion der zur Dosierung verwendeten Polymerlösung. h, Abbildung von MNPs, die mit dem Gerät hergestellt wurden: MNP auf Acryl-Festträger (oben links), SEM-Bild von MNPs mit konischer (oben rechts) und Pyramiden- (unten links) Geometrie und einem einzelnen Pyramiden-MNP (unten rechts). i, Bilder von an der Spitze geladenen MNPs (weiß umrandet), die gemeinsam mit dem Gerät abgegeben werden, wobei roter (oben) oder blauer (unten) Farbstoff als Modellladung verwendet wird. j, MNP-Produktionsdurchsatz. k, MNP-Durchsatz als Funktion der Trocknungszeit und der Druckfachlänge. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD (e, g) oder den Mittelwert ± 95 % Konfidenzintervall (f) dar. P-Werte werden dargestellt durch: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. NS, nicht signifikant.

Der Mikronadeldruck erfordert den Einbau eines stabilisierenden löslichen Polymers in eine konsistent dispensierbare mRNA-LNP-Tinte. Nach einem umfassenden In-vitro-Screening der Tinten haben wir festgestellt, dass eine Kombination löslicher Polymere erfolgreich aktive LNP-verkapselte mRNA liefern und die Stabilität für mindestens 6 Monate bei Raumtemperatur aufrechterhalten kann. Unter Verwendung von mRNA, die für die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) des SARS-CoV-2-Spike-Proteins (S) kodiert, zeigen wir, dass vom MVP produzierte MNPs über ausreichende mechanische Eigenschaften verfügen und bei Ex-vivo-Anwendung erfolgreich in die Epidermis von Schweinen eindringen. In-vivo-Tests manuell hergestellter MNPs zeigten eine ähnliche Immunantwort wie bei IM-Verabreichung.

Wir haben eine vakuumbasierte Technik entwickelt, um viskose Impfstofftinten in Formen zu treiben. Der Prozess basiert auf der Luftdurchlässigkeit und Löslichkeit in Polydimethylsiloxan (PDMS)29. Durch Anlegen von Vakuum entweder direkt an den Boden der PDMS-Form während des Befüllens (Abb. 1d und erweiterte Daten, Abb. 1a) oder durch Vorentgasen der PDMS-Form unmittelbar vor dem Befüllen (erweiterte Daten, Abb. 1b) entstehen viskose Lösungen aus Polymer und Impfstoff konnte in Formen geladen werden (Ergänzungsvideos 1 und 2).

Für beide Ansätze wurde der Einfluss verschiedener Prozess- und Designparameter auf die Ladezeit und die MNP-Bildung untersucht (Extended Data Abb. 1c–j). Wenn Vakuum direkt an die Form angelegt wird, hängt die Ladezeit von der Dicke und Zusammensetzung der PDMS-Folie, dem Muster, das zum Anlegen des Vakuums unterhalb der PDMS-Form verwendet wird, und dem angelegten Druckgradienten ab (Abb. 1e). Das Laden zunehmend viskoserer Tinten (Extended Data Abb. 1k) dauerte weniger als 20 Minuten. Obwohl die Anwendung von Vakuum während der Herstellung von Mikronadeln üblich ist, wird in der Regel Vakuum an die Atmosphäre über der Form angelegt, was zur Bildung von Blasen im Impfstoff und in der Polymerlösung führt30,31. Das Anlegen von Vakuum direkt an die PDMS-Form verhindert die Blasenbildung und macht eine Zentrifugation überflüssig. Dadurch wird ein wiederholbarer Prozess ermöglicht, der eine Automatisierung ermöglicht, und er kann vergrößert oder verkleinert werden, um jede MNP-Größe oder -Menge zu erfüllen.

Um Impfstoffabfall und Trocknungszeit zu reduzieren, haben wir die minimal mögliche Menge an Impfstofftinte abgegeben, die zum Befüllen der Mikronadeln erforderlich ist. Wir haben die Polymerkonzentration so eingestellt, dass ein dünner, homogener Film aus getrocknetem Polymer mit ausreichender mechanischer Festigkeit entsteht, um das Entformen zu überstehen (Erweiterte Daten, Abb. 2a). Die Abgabe war durch die Tropfenfläche der abgegebenen Tinte und die Kreisform des nach dem Trocknen gebildeten Trägers gekennzeichnet. Durch die Erhöhung der Viskosität zur Minimierung des Marangoni-Effekts – der Polymer und Impfstoff an die Ränder des trocknenden Tropfens treibt – maximierten wir die Rundheit und Formabdeckung, gemessen in gefüllten Nadeln pro Form (Erweiterte Daten, Abb. 2b, c). Mithilfe einer thermogravimetrischen Analyse zur Bewertung der Trocknungszeit haben wir festgestellt, dass die MNP-Formen bei gleichzeitiger Anwendung eines Vakuums unten und einer trockenen Vakuumatmosphäre darüber das Patch-Trocknen ohne Blasenbildung beschleunigten (Abb. 1f und Ergänzende Anmerkung 1).

Um die Benutzerinteraktion und den Bedarf an Schulungen vor Ort zu minimieren, wurden die oben genannten Prozesse mithilfe programmierbarer Komponenten automatisiert. Es wurde eine kundenspezifische x-y-Translationsstufe mit Vakuum unten (Beladen) und oben (Trocknen) hergestellt, die bis zu 100 MNP-Formen gleichzeitig aufnehmen kann (Zusatzvideo 3 und erweiterte Daten Abb. 3a–e). Die Vakuumlade- und Vakuumtrocknungsprozesse wurden mit einem Roboterarm kombiniert, um eine wiederholbare und programmierbare Abgabe mit Präzision im Mikrolitermaßstab zu ermöglichen (Ergänzungsvideos 4 und 5 und erweiterte Daten, Abb. 3f). Parameter wie Abgabemuster, abgegebenes Volumen und Abgabehöhe wurden optimiert, um Impfstoffverschwendung zu minimieren und MNPs mit ultradünnem Träger zu erhalten (Extended Data Abb. 3g–k). Mit einem Satz von Dosierparametern wurden drei verschiedene lösliche Polymersysteme mit einer Formabdeckung von mehr als 80 % dosiert (Abb. 1g). Das MVP ermöglichte die automatisierte Herstellung verschiedener Mikronadeldesigns, einschließlich 10 × 10 Arrays (Extended Data Abb. 3l) von Pyramiden- und konischen Mikronadeln mit einer Höhe von bis zu 1.500 µm, hergestellt aus einer Auswahl löslicher Polymere, die für die Impfstoffabgabe mithilfe von MNPs üblich sind (Abb. 1h). ).

Impfstoff, der im Träger des MNP trocknet, erzeugt zusätzlichen Impfstoffabfall. Um den Abfall zu reduzieren, haben wir einen zweistufigen Spitzenladeprozess implementiert, der zuvor zur Konzentration des Impfstoffs in Mikronadelspitzen verwendet wurde8,32. Zunächst wird eine Impfstofftinte, die die zur Stabilisierung des Impfstoffs erforderliche Mindestmenge an Polymer enthält, in die Form gefüllt und getrocknet. Anschließend wird eine reine Polymertinte aufgetragen und getrocknet, um den Träger zu bilden (Erweiterte Daten Abb. 4a,b). Der MVP kann auch zum gleichzeitigen Laden mehrerer Ladungen an der Spitze verwendet werden, wie die Beladung mit rotem und blauem Farbstoff in verschiedenen MNPs zeigt (Abb. 1i). Spitzenbeladene MNPs, die mit dem MVP gedruckt wurden, weisen zu 100 % korrekt geformte, scharfe Mikronadeln auf (Erweiterte Daten, Abb. 4c).

Es wurde ein mathematisches Modell entwickelt, um die Anzahl der pro Tag herstellbaren Patches als Funktion verschiedener Designparameter zu quantifizieren (Ergänzende Anmerkungen 2 und 3 und erweiterte Daten Abb. 4d – g). Der Durchsatz des MVP wird durch den langsamsten Prozessschritt begrenzt, der je nach Gerätegröße entweder der Abgabeschritt oder der Trocknungsschritt sein kann, was zeigt, wie wichtig es ist, beides zu verstehen (Abb. 1j). Eine kontinuierliche Verarbeitung ist möglich, wenn die Komponentenprozesse ständig laufen und die Dosier- und Trocknungsdurchsätze gleich sind. Verschiedene Designkonturen wurden aufgezeichnet, um den Durchsatz für jedes Gerät zu erfassen, wobei Parameter wie Trocknungszeit und Abmessung der Ladeschale (Abb. 1k) oder Patchgröße (erweiterte Daten, Abb. 4d) berücksichtigt wurden.

Obwohl ein Drucker der ersten Generation in der Lage ist, 100 Pflaster in 48 Stunden herzustellen, kann diese Zahl durch eine Änderung der Größe und Komplexität der Ausgabestufe und des Trocknungsbereichs gesteigert werden. Das Modell kann ein integratives Werkzeug sein, um Entwurfsüberlegungen zur Erhöhung des Durchsatzes zu unterstützen. Dies kann effizient erreicht werden, indem modulare Mikronadel-Tablettformen vertikal innerhalb des MVP gestapelt werden (Erweiterte Daten, Abb. 5a, b) oder kontinuierlich MNPs hergestellt werden, indem eine Vorbehandlungsstufe verwendet wird, um Tabletts mit Mikronadel-Formen vor der Abgabe zu entgasen (Erweiterte Daten, Abb. 5c). ). Das Entfernen und Verpacken von Pflastern könnte in zukünftigen Designs möglicherweise auch mithilfe eines Roboterarms automatisiert werden (Extended Data Abb. 5d–g).

Das MVP wurde dann verwendet, um verschiedene Biologika zu laden, insbesondere Protein-, DNA- und mRNA-beladene LNPs. Die zweistufige Spitzenbeladung mit BSA erhöht die Beladungseffizienz deutlich – definiert als der Prozentsatz der für die Herstellung verwendeten Ladung, der in den Mikronadelspitzen gemessen wird – im Vergleich zur einstufigen MNP-Herstellung (Abb. 2a). Die Masse der Impfstofftinte, die im ersten Schritt des zweistufigen Prozesses verwendet wird, wurde dann optimiert, um eine hohe Beladungseffizienz zu erzielen (Erweiterte Daten Abb. 6a,b). Wir haben beobachtet, dass die Beladungseffizienz mit abnehmender Formulierungsmasse zunimmt (Extended Data Abb. 6c). Unter Verwendung des besten Ladeverfahrens wurden 32 µg DNA und 90 µg BSA mit der Spitze geladen und gleichzeitig mit dem MVP abgegeben, mit ähnlicher Ladeeffizienz (Abb. 2b). Die mit dem MVP erreichte Beladung entsprach der, die man erhält, wenn die MNPs manuell mit Standardlabortechniken hergestellt werden, was die erfolgreiche Automatisierung des Herstellungsprozesses für verschiedene Antigene und Vektoren weiter bestätigt (Abb. 2b). Die Abgabehöhe wurde verringert, um die Belastungsvarianz zu verringern (Erweiterte Daten, Abb. 6d). Die Beladung mit einem DNA-Impfstoff erfolgt gleichmäßig (sd = 1,6 µg) über die gesamte Oberfläche einer Schale mit 100 MNP-Schimmelpilzen, ohne erkennbare Trends als Funktion der Position (Abb. 2c und erweiterte Daten Abb. 6e).

a, Ein- und zweistufige Mikronadel-Beladungseffizienz (n = 6 unabhängige Proben). b: Die Effizienz der DNA- und Proteinbeladung in manuell hergestellten MNPs ähnelt denen, die mit dem MVP hergestellt wurden (n = 4–9 unabhängige Proben). c, Wärmekarte, die die gleichmäßige Beladung von MNPs mit DNA auf einem 10 × 10 großen Tablett mit MNP-Formen zeigt. Jedes Quadrat ist ein individueller Patch. Schwarze Pfeile zeigen die Bewegung des Impfstoffspenders an. d, MNPs bestehen aus stabilisierendem Polymer und LNPs, die aus vier Lipidkomponenten bestehen. e,f, LNPs, die mRNA einkapseln, die für fLuc kodiert, wurden mit verschiedenen wasserlöslichen Polymeren gemischt und getrocknet. Die Proteinexpression in HeLa-Zellen wurde nach der Transfektion mit wieder aufgelöstem Polymer gemessen, um nach einer Kombination von Polymeren zu suchen, die eine ähnliche Proteinexpression wie LNPs in Suspension erzeugt (n = 4 technische Replikate). g, Mikronadeln lösen sich auf und geben mRNA-LNP-Impfstoffe in den intradermalen Raum ab. h, Lumineszenz 6 Stunden nach der Fußballenanwendung von MNPs bei Mäusen für LNPs, die mit Lipid 5 oder cKK-E12 hergestellt wurden (n = 5 biologisch unabhängige Proben). i, Vergleich der IM-, manuell hergestellten MNP- und gedruckten MNP-Verabreichung von Lipid-5-LNPs mit 1 µg fLuc-mRNA (n = 5 biologisch unabhängige Proben). Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (a, b, e, f) oder den Mittelwert ± Standardabweichung (h, i) dar. Es wurden ungepaarte, zweiseitige t-Tests (a,b), gewöhnliche zweifaktorielle ANOVA (h) oder gewöhnliche einfaktorielle ANOVA (i) (Sidaks Mehrfachvergleichstest) verwendet. P-Werte werden dargestellt durch: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. Ave., Durchschnitt; dev., Abweichung; NS, nicht signifikant.

Als nächstes testeten wir das Drucken von MNPs, die mRNA-LNPs enthalten, die in einer löslichen Polymermatrix stabilisiert sind. LNPs lassen sich in einer festen Matrix besonders schwer trocknen, da sowohl die chemische als auch die kolloidale Stabilität erhalten bleiben müssen33. Darüber hinaus ist das in den Mikronadeln verfügbare Polymervolumen begrenzt, was es schwierig macht, die LNP-Aggregation zu verhindern. Um auflösbare Polymere zur Stabilisierung von LNPs zu untersuchen, verglichen wir verschiedene biokompatible Polymere, die üblicherweise zur Herstellung auflösbarer Mikronadeln verwendet werden, basierend auf ihrer Fähigkeit, die LNP-Stabilität bei abnehmenden Polymer-zu-mRNA-Massenverhältnissen aufrechtzuerhalten. LNPs mit einem Durchmesser von ungefähr 147 nm und einem Oberflächenpotential von –2,7 ± 0,6 mV, die mRNA einkapseln, die für Glühwürmchen-Luciferase (fLuc) kodiert, wurden unter Verwendung von ionisierbarem Lipid, Phospholipid, Cholesterin und pegyliertem Lipid hergestellt (Abb. 2d und erweiterte Daten Abb. 7a – c)34.

Anschließend wurden LNPs mit verschiedenen löslichen Polymeren gemischt und getrocknet. Nach erneuter Auflösung der trockenen Matrix wurden LNPs zur Transfektion von HeLa-Zellen verwendet und sowohl die Lebensfähigkeit der Zellen als auch die fLuc-Expression wurden im Vergleich zu frischen, ungetrockneten LNPs gemessen. Keine der getesteten Formulierungen beeinträchtigte die Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich zu LNPs allein (Extended Data Abb. 7d). Formulierungen, die mehr als 50 % Polyvinylalkohol (PVA) der Gesamtmasse enthalten, eignen sich am besten zur Stabilisierung von LNPs (Abb. 2e), wohingegen andere gängige lösliche MNP-Materialien eine schlechte Leistung erbringen (Abb. 2f). Die langsame Trocknungsgeschwindigkeit (Erweiterte Daten, Abb. 7e), Hygroskopizität und Viskosität (Erweiterte Daten, Abb. 1k) von PVA können durch Mischen mit Polyvinylpyrrolidon (PVP – ein schneller trocknendes Polymer mit wünschenswerten mechanischen Eigenschaften (Erweiterte Daten, Abb. 7f, g)) überwunden werden ) – ohne Einbußen bei der Stabilität. LNPs sind nach der Auflösung der MNP-Polymermatrix intakt – zeigen eine moderate Zunahme des Durchmessers (Extended Data Abb. 7h), eine typische Struktur bei der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) (Extended Data Abb. 7i–k) und bleiben erhalten mRNA-Größe (Extended Data Abb. 7l).

Wir wollten aus zwei verschiedenen führenden ionisierbaren Lipiden mit sehr unterschiedlichen Strukturen und pKa-Werten eine LNP-Formulierung auswählen, die für die ID-Verabreichung über MNP geeignet ist (Abb. 2g): cKK-e12 und Lipid 5 (Lit. 34, 35, 36). Von cKK-e12 wurde ausführlich berichtet, dass es Oligonukleotide über intravenöse (IV) Verabreichung effizient abgibt, während Lipid 5 aus einer Familie von Lipiden ausgewählt wurde, die sowohl für die intravenöse als auch für die intravenöse Verabreichung untersucht wurden. LNPs jedes Typs, die fLuc-mRNA einkapseln, wurden charakterisiert (Extended Data Abb. 7a – c) und in die Mikronadeln von MNPs geladen, wobei die am besten stabilisierende auflösbare Polymerformulierung und die effizienteste Beladungsmethode verwendet wurden – das heißt, ein Massenverhältnis von PVP: PVA von 1: 1 und zweistufige Fertigung. Die eingekapselte mRNA-Beladung in jeder der 100 Mikronadeln eines MNP wurde gemessen. Wir fanden heraus, dass die mRNA-Verteilung innerhalb des MNP zwar heterogen ist, die Variation von Charge zu Charge jedoch gering ist und etwa 1,0 µg mRNA-Spitze pro MNP geladen werden (Extended Data Abb. 7m–p). Die Proteinexpression nach HeLa-Transfektion mit LNPs oder aus dem Mikronadelpflaster wieder aufgelösten LNPs zeigte, dass der MNP-Herstellungsprozess die LNP-Aktivität in vitro nicht beeinflusst (Extended Data, Abb. 7q). MNPs wurden auf die Fußballen von Mäusen aufgetragen und die fLuc-Expression wurde mittels Lumineszenz gemessen37. LNPs mit Lipid 5 weisen eine viel stärkere Proteinexpression in der Dosisreaktion auf als cKK-e12 (Abb. 2h), was für eine weitere Verwendung bei der ID-Verabreichung vielversprechend ist.

Um die ID-Verabreichung eines LNP-basierten mRNA-Impfstoffs unter Verwendung von MNPs zu untersuchen, haben wir erneut die Proteinexpression in vivo unter Verwendung von in LNPs eingekapselter fLuc-mRNA gemessen und dieses Mal die ID-Fußpolsteranwendung von MNP mit der IM-Verabreichung einer äquivalenten Menge an fLuc-mRNA in LNPs verglichen (Abb . 2i). Die Proteinexpression nach 24 Stunden ist deutlich höher, wenn LNPs über MNPs statt über IM-Injektion verabreicht werden. Wir haben auch die Proteinexpression verglichen, wenn MNPs manuell hergestellt wurden und mit dem MVP gedruckt wurden. Der automatisierte Druckprozess hat keinen Einfluss auf die LNP-Aktivität in vivo (Abb. 2i).

Wir haben die mechanischen und funktionellen Eigenschaften von MNPs bewertet, die mit der Kombination von Polymeren hergestellt wurden, die am besten zur Stabilisierung von LNPs geeignet sind. Sowohl konische als auch Pyramidennadeln wurden als potenziell praktikable Geometrien angesehen, die unterschiedliche Abgabevolumina und Spitzenwinkel bieten (Erweiterte Daten, Abb. 8a und Ergänzungstabelle 1), die nachweislich die Hautpenetration und -auflösung beeinflussen38. Sowohl hinsichtlich der Spitzenkraft (Abb. 3a) als auch der Steifigkeit (Abb. 3b) übertreffen Pyramiden-MNPs aus PVP:PVA konische MNPs derselben Zusammensetzung, und alle MNPs erfüllen die Mindestanforderungen zum Durchstechen der Haut39. Für beide Geometrien wurde die Ex-vivo-Punktion der Schweinehaut (Abb. 3c) histologisch ausgewertet, und die Auflösung der Mikronadeln wurde durch Bildanalyse mit optischer Mikroskopie ausgewertet (Abb. 3d, e und erweiterte Daten Abb. 8b). Obwohl beide Geometrien Zugang zur Dermis haben, lösten sich 36 % des Volumens der Pyramiden-Mikronadel in 10 Minuten auf, verglichen mit nur 8 % des Volumens der konischen Mikronadel, was eine stärkere Impfstoffabgabe ermöglicht – möglicherweise aufgrund ihres kleineren, schärferen Spitzenwinkels40. Daher wurden für alle folgenden Experimente Pyramiden-MNPs verwendet. Durch Erhöhen des Anteils von PVP (Extended Data Abb. 8c–e) und LNPs (Extended Data Abb. 8f) in der Mischung kann das gelöste Volumen erhöht werden.

a,b, Pyramiden-MNPs aus PVP:PVA sind steifer (a) und fester (b) als konische MNPs ähnlicher Größe (n = 10 unabhängige Proben). Ungepaarte zweiseitige t-Tests. c: Sowohl konische als auch Pyramiden-MNPs sind in der Lage, die Epidermis (e) zu durchdringen (schwarze Pfeile) und für die ID-Abgabe auf die Dermis (d) zuzugreifen. d,e, Pyramiden-MNPs lösen sich deutlich schneller auf als konische MNPs unter Verwendung der optischen Bildgebung e vor und nach der Anwendung (n = 3 unabhängige Proben). Ungepaarte zweiseitige t-Tests. f, GMTs sind zwischen IM und MNP für SARS-CoV-2-RBD-mRNA ähnlich (n = 5 biologisch unabhängige Proben). Gewöhnliche zweifaktorielle ANOVA (Sidaks Mehrfachvergleichstest). g, Anti-RBD-Protein-IgG-Titer bis Woche 11, die die unterschiedliche Kinetik humoraler Reaktionen zwischen MNP- und IM-Verabreichung und ähnliche Reaktionen für SARS-CoV-2-RBD-mRNA zeigen (n = 5 biologisch unabhängige Proben). h, Reaktionen des Elektrochemilumineszenz-Serum-Anti-RBD-Bindungstests für SARS-CoV-2-Varianten, die ähnliche Reaktionen für IM und MNP mit SARS-CoV-2-RBD-mRNA zeigen (n = 5 biologisch unabhängige Proben). Gewöhnliche zweifaktorielle ANOVA (Sidaks Mehrfachvergleichstest). i, PVP:PVA stabilisiert mRNA-LNPs in MNPs für eine hohe Proteinexpression nach 6 Monaten Lagerung bei Raumtemperatur (n = 5 biologisch unabhängige Proben). Jeder Datensatz wird mit einer linearen Anpassung dargestellt und das 95 %-Konfidenzintervall ist schattiert. j, Designbeziehung zur Erfüllung der Dosierungsanforderungen beim Menschen für gängige mRNA-Impfstoffe, die die Beziehung zwischen dem Volumen einzelner Mikronadeln, Mikronadeln pro MNP und der in einem einzelnen MNP abgegebenen Dosis veranschaulicht. Schwarze Pfeile geben die Größe (in Mikronadeln pro MNP) an, bei der eine menschliche mRNA-Dosis für das in diesen Studien verwendete konstante Einzelmikronadelvolumen ausreicht. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (a, b, d) oder den Mittelwert ± Standardabweichung (f–i) dar. P-Werte werden dargestellt durch: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. MPa, Megapascal; N, Newton; NS, nicht signifikant.

Um einen SARS-CoV-2-Impfstoff zur Verabreichung durch MNP zu entwickeln, verwendeten wir eine mRNA, die für die RBD kodiert und mit einem T4-Trimerisierungsmotiv modifiziert wurde, ähnlich dem Konstrukt im BNT162b1-Impfstoff (Extended Data Abb. 9a)41. Vor der zweistufigen Beladung wurden LNPs, die SARS-CoV-2-mRNA enthielten, in Wasser dialysiert und mithilfe einer Zentrifugalfiltration konzentriert, um die MNP-Beladungskapazität zu erhöhen (Extended Data Abb. 9b, c)42. Bei LNPs wurde die Ladeeffizienz auch durch die Herstellung kleinerer MNPs erhöht, wodurch der Marangoni-Effekt auf den von Mikronadeln bedeckten Bereich und nicht auf den Umfang des Pflasters beschränkt wird (Extended Data Abb. 9d, e). Ansonsten wurden MNPs gemäß der in den Abbildungen beschriebenen zweistufigen Beladung hergestellt. 1 und 2, wobei PVP:PVA 1:1 bei einem Massenverhältnis von 0,32 (mg µg –1) verwendet wird, um LNPs und das ionisierbare Lipid Lipid 5 zu stabilisieren, um die intradermale Proteinexpression zu maximieren. Wir verwendeten HEK-Zellen, um die Expression der SARS-CoV-2-mRNA-basierten Vektoren zu bestätigen (Extended Data Abb. 9f).

Basierend auf früheren Berichten verwendeten wir ein Mausmodell, um die Immunogenität des SARS-CoV-2-Impfstoffs zu bewerten43. Die Impfstoffe wurden in einer Dosis von 6 μg eingekapselter mRNA (Extended Data Abb. 9g – i) über MNP an das Fußballen von C57BL/6-Mäusen verabreicht, und 28 Tage später wurde ein MNP-Boost verabreicht (Extended Data Abb. 10a). Als Kontrolle wurde nach dem gleichen Zeitplan eine Suspension von mRNA-LNPs mit einer mRNA-Dosis von 10 μg per IM-Injektion in die Hinterbeine verabreicht. Das Serum wurde alle zwei Wochen gesammelt und auf bindende Anti-RBD-IgG-Titer analysiert. Drei Wochen nach der Auffrischungsimpfung haben wir ähnliche geometrische Mitteltiter (GMTs) zwischen IM und MNP für den RBD-mRNA-Impfstoff gemessen (Abb. 3f). Die Post-Prime-Reaktionen sind geringer als diejenigen, die für zugelassene SARS-CoV-2-mRNA-LNP-Impfstoffe in einem C57BL/6-Modell berichtet wurden, die unterschiedliche mRNA und Lipide verwenden, aber die Post-Boost-Reaktionen sind ähnlich43,44.

Obwohl alle Mäuse, die die mRNA-LNPs erhalten, letztendlich hohe GMTs produzieren, reagieren diejenigen, die sie IM erhalten, innerhalb einer Woche auf die Auffrischung, während diejenigen, die sie über MNP erhalten, innerhalb von 3 Wochen auf die Auffrischung reagieren (RBD-mRNA; Abb. 3g). Wir beobachteten auch, dass die Kinetik der FLuc-Expression nach MNP-Verabreichung langsamer ist als nach IM-Verabreichung (Extended Data, Abb. 10b). Dies ist zu erwarten, da sich mRNA-LNPs über MNP aus einer festen Matrix in der Haut auflösen, aber eine Verzögerung der Proteinexpression könnte helfen, die Verzögerung der Immunantwort im Vergleich zur Dosierung einer flüssigen Suspension zu erklären. Angesichts der etwas niedrigeren, aber ähnlichen Spitzen-GMTs (Abb. 3f) und ihrer Korrelate des Schutzes mit einer SARS-CoV-2-Infektion führten RBD-mRNA-MNPs dennoch innerhalb eines machbaren Zeitraums nach der Verabreichung zu einer robusten Immunantwort45. Wir verwendeten einen Multiplex-Elektrochemilumineszenz-Assay, um die Anti-RBD-Bindungsreaktionen im Serum auf SARS-CoV-2-S-Proteinvarianten mit verschiedenen interessierenden Mutationen zu untersuchen und den Umfang des Schutzes zu demonstrieren, den der MNP-Impfstoff bietet (Abb. 3h).

Wir verglichen die PVP:PVA-Mischung, die für die mRNA-LNP-Abgabe durch Mikronadeln entwickelt wurde, mit einer herkömmlichen mRNA-LNP-Suspension, die IM in derselben Dosis verabreicht wurde, und verwendeten dabei fLuc-mRNA als Modell für die Proteinexpression in Mäusen. Beide wurden bei Raumtemperatur und 4 °C gelagert und 1 Monat, 3 Monate und 6 Monate später in vivo beurteilt. Obwohl die Wirksamkeit der IM-Suspension im Laufe von 6 Monaten abnimmt, erzeugen MNPs über den gesamten Lagerzeitraum hinweg eine konstant hohe Lumineszenz (Abb. 3i), selbst wenn sie bei Raumtemperatur gelagert werden. MNPs halten mRNA-LNPs auch stabil, wenn sie einen Monat lang bei 37 °C gelagert werden, was der Lagerzeit zwischen dem Prime und dem Boost entspricht (Extended Data Abb. 10c). In einer ähnlichen Studie sind RBD-mRNA-MNPs nach mindestens dreimonatiger Lagerung bei Raumtemperatur und 4 °C immunogen (Extended Data Abb. 10d), wenn sie als Booster für BALB/c-Mäuse verwendet werden, die mit mRNA-LNP-Suspension grundiert wurden.

Die Bereitstellung einer ausreichenden Dosis LNP-Impfstoff mit MNPs ist aufgrund der zur Stabilisierung der LNPs erforderlichen Polymermasse eine Herausforderung. Unter Verwendung des Nadelvolumens und der MNP-Beladungseffizienz aus der Anti-RBD-Titer-Peak-Studie haben wir ein Modell entworfen (Abb. 3j und Ergänzende Anmerkung 4), das die Kombination aus Volumen und Anzahl der Mikronadeln vorhersagt, die zur Abgabe der vollständigen Moderna (mRNA-1273) erforderlich sind ) oder Pfizer-BioNTech (BNT162b1) COVID-19-Impfstoffdosen. Das Modell sagt voraus, dass 360 bzw. 108 der untersuchten Pyramiden-Mikronadeln und -Formulierungen die volle Dosis der Impfstoffe Moderna bzw. Pfizer-BioNTech abgeben würden. MNPs mit ausreichender Dosis haben einen Durchmesser von weniger als 2 cm.

Obwohl das Ausmaß der humoralen Reaktionen ähnlich ist, beobachteten wir interessante Unterschiede zwischen der IM-Verabreichung einer mRNA-LNP-Suspension und der ID-Verabreichung von mRNA-LNPs unter Verwendung von MNPs. mRNA-LNPs mit Lipid 5 übertrafen diejenigen mit cKK-E12 hinsichtlich der Proteinexpression (Abb. 2h), was darauf hindeutet, dass MNPs möglicherweise empfindlich auf die ionisierbare Lipidzusammensetzung reagieren. Ionisierbare Lipide steuern die Proteinexpression und das Targeting und wurden für verschiedene Organe und Verabreichungswege optimiert34,35,46,47. Humorale Reaktionen entwickeln sich auch schneller im IM (Abb. 3g). Frühere Untersuchungen zu Impfstoffen auf Mikronadelbasis legen einen Zusammenhang zwischen der Verabreichungsmethode und der Kinetik der humoralen Reaktion nahe48,49. Dies kann auf die langsamere Auflösung der MNP-Matrix (Extended Data Abb. 10b) oder grundlegende Unterschiede zwischen ID- und IM-Verabreichung zurückzuführen sein. Diese Unterschiede verdeutlichen Möglichkeiten zur weiteren Untersuchung und Entwicklung der Wirksamkeit von mRNA-LNPs, die von MNPs bereitgestellt werden. Darüber hinaus könnten RBD-mRNA-Konstrukte eine weitere Untersuchung als Ziel für Impfstoffe mit erhöhter Stabilität rechtfertigen50.

MNPs, die mRNA-LNPs enthalten, bieten neue Möglichkeiten, die Impfstoffverabreichung zu rationalisieren und die Wirksamkeit des Impfstoffs zu verbessern. Die intravenöse Verabreichung von abgeschwächten Viren, virusähnlichen Partikeln und anderen Impfstoffen kann eine Dosiseinsparung im Vergleich zur intramuskulären oder subdermalen Verabreichung ermöglichen51,52. Auf einem Treffen der strategischen Beratergruppe der Weltgesundheitsorganisation wurde die Verabreichung von Impfstoffen per ID empfohlen, um die Kosten für den Polio-Impfstoff zu senken. Außerdem wurde in Indien ein DNA-Impfstoff, der per Jet-Injektor per ID verabreicht wird, für den Notfalleinsatz in Indien zugelassen53,54. Bei Raumtemperatur stabile Impfstoffe würden den Einsatz in Entwicklungsländern erheblich erleichtern, wo die für den Kühltransport erforderliche Lieferkette möglicherweise unzureichend ist. Sie würden auch eine kosteneffiziente Bevorratung von Impfstoffen ermöglichen, um auf einen möglichen Ausbruch vorbereitet zu sein55. Insbesondere der Einsatz von COVID-19-Impfstoffen wurde durch die schlechte Haltbarkeit und die Abhängigkeit von Kühlketten-Lagerungs- und Transportsystemen behindert. Bisher wurden unseres Wissens noch keine thermostabilen mRNA-LNP-Impfstoffe entwickelt33,56, möglicherweise aufgrund ihrer nanopartikulären Natur (z. B. sehr große Oberfläche) und der Tendenz zur irreversiblen Aggregation, was ihre Stabilisierung im Trockenen außerordentlich schwierig macht Formulierung33,57,58,59.

Wir zeigen, dass vom MVP gedruckte MNP-Impfstoffe bei Raumtemperatur gelagert und noch Monate nach der Herstellung für Impfungen verwendet werden können. Im Gegensatz dazu müssen bestimmte aktuelle mRNA-Impfstoffe für die Langzeitlagerung bei –60 °C bis –80 °C und für die Kurzzeitlagerung bei 4 °C aufbewahrt werden. Modellierungsdaten legen nahe, dass eine menschliche Dosis des mRNA-LNP-COVID-19-Impfstoffs in einem 2 cm² großen Mikronadelpflaster formuliert werden kann (Abb. 3j). Dabei wird davon ausgegangen, dass der Nadel-zu-Nadel-Abstand mit zunehmender Patchgröße beibehalten wird, für eine eventuelle Translation müssen jedoch die Hautpenetration und die Nadelauflösung eines größeren Pflasters bewertet werden. Zusätzliches Engineering des MVP wird erforderlich sein, um einen End-to-End-Mikronadel-Herstellungsprozess für die Anwendung beim Menschen zu entwickeln, einschließlich eines aseptischen Gehäuses zur Reduzierung der Keimbelastung und eines integrierten Verpackungsschritts60,61. Wir glauben, dass das Gerät leicht an jeden mRNA-Impfstoff für Krankheiten angepasst werden könnte, die in bestimmten Regionen von Interesse sind, und dass die Größe entsprechend dem gewünschten Umfang der MNP-Impfstoffproduktion angepasst werden könnte.

Das MVP wurde mit der Anforderung entwickelt, die notwendigen Funktionen zu integrieren und zu automatisieren, um die für die Herstellung von MNPs erforderlichen Zutaten in fertige MNPs umzuwandeln, und zwar mit minimalen Bedienerkenntnissen und in einem für den Transport geeigneten Formfaktor. Das resultierende Design bestand aus drei Hauptfunktionen: Beladen, Ausgeben und Trocknen. Diese drei Funktionen wurden im MVP (Extended Data Abb. 3f) organisiert und so programmiert, dass sie gleichzeitig funktionieren. Die gesamte MVP-bezogene Programmierung wurde in der Programmiersprache EPSON RC 7.0 SPEL implementiert. Der Bediener muss Formen beladen, die Behälter für flüssige Formulierung und Polymerträger füllen und MNPs entladen.

Eine wichtige Betriebsfunktion wurde so entwickelt, dass während des Abgabeschritts die flüssige Formulierung zunächst über der MNP-Form abgegeben und dann mithilfe des darunter liegenden Vakuums in den Negativformhohlraum gesaugt wird (dauert etwa 15 Minuten) und dann die Ladephase in die Negativform übergeht Trocknungsstation, deren Atmosphäre versiegelt ist, um die Trocknungszeit zu beschleunigen.

Die Abgabestufe besteht aus einer Spritzenpumpe (Harvard PHD 2000) und einem Roboterarm (Epson T3), der ein Paar Düsen (18-Gauge-Nadeln für Farbstofflösungen, 25-Gauge-Nadeln für den Impfstoffdruck) hält, die über einen Schlauch mit der Spritzenpumpe verbunden sind. Die Bewegung des Roboterarms wurde so programmiert, dass sie mit der Spritzenpumpe synchronisiert wird. Die Bewegung des Roboterarms/der Roboterpumpe wurde optimiert, um die Abdeckung der MNP-Form durch die flüssige Formulierung zu maximieren. Zwischen jeweils zwei benachbarten MNPs wurde eine zeitliche Lücke für die Abgabe festgelegt, um Tropfen zwischen den Pflastern und Impfstoffverschwendung zu minimieren.

Beide Prozesse basierten auf unterschiedlichen Sequenzen der Anwendung von Vakuum auf PDMS-Formen und der Abgabe der Polymerlösung (beladen mit Farbstoff oder biologischen Wirkstoffen) sowie der anschließenden Vakuumtrocknung. Im ersten Prozess (Entgasung) wurde zunächst Vakuum auf leere PDMS-Formen angelegt, gefolgt von der Abgabe der Polymerlösung innerhalb einer bestimmten Zeit (~7 Minuten) direkt nach dem Anlegen des Vakuums und schließlich dem Trocknen der Polymerlösung mit Vakuum. Die Vakuumentgasung erleichterte die Diffusion der Polymerlösung in die Mikronadelhohlräume in der PDMS-Form (Erweiterte Daten, Abb. 1b und Zusatzvideo 1). Beim zweiten Ansatz wurde die Polymerlösung auf die PDMS-Form verteilt und anschließend sowohl von der Unterseite als auch von der Oberseite der Platten Vakuum angelegt (Erweiterte Daten, Abb. 1a und Zusatzvideo 2), um die Diffusion des Polymers zu induzieren, aber auch die Trocknungszeit zu beschleunigen ohne Blasenbildung. Beim Trocknen der Lösung mittels Vakuum ist es wichtig, den Druckgradienten durch die PDMS-Form aufrechtzuerhalten, indem ein höherer Unterdruck unter der PDMS-Folie aufrechterhalten wird. Dadurch wird die in der Polymer-Impfstoff-Lösung gelöste Luft nach unten (in Richtung der Vakuumkammer unter der PDMS-Form) gedrückt, wodurch eine Blasenbildung während des Trocknens vermieden wird. Aufgrund der Einfachheit der Automatisierung wurde der zweite Ansatz weiter in das Gerät implementiert.

Die Ladestufe war eine maßgeschneiderte 10 × 10-Anordnung von MNP-Formen, die zum Anlegen eines Vakuums (–1 bar) unter den PDMS-Platten verwendet wurde. Der Ladetisch war an einem einachsigen Bewegungstisch (Thorlabs) befestigt, der den Transfer zwischen der Ladestation und der Trocknungsstation ermöglichte. Vor der Abgabe der Formulierung wurde die Ausrichtung der Ladestation mit der Abgabestation kalibriert.

Bei der Trocknungsstufe handelte es sich um eine speziell angefertigte Vakuumkammer, die sich über einen einachsigen Bewegungstisch (Thorlabs) vertikal bewegte. Die Kopfabdeckung umfasste einen Vakuumanschluss sowie einen Trockenmittelbeutel (Extended Data Abb. 3c). Um die Trocknung zu beschleunigen, wurde das Vakuum auf –0,6 bar eingestellt. Sowohl für die Beladungs- als auch für die Trocknungsphase wurde eine einzige Vakuumpumpe verwendet. Die Vakuumpumpe war direkt mit der Ladestufe verbunden und ein Druckregler wurde verwendet, um das Vakuum im Kopfdeckel auf –0,6 bar zu senken. Das geringere Vakuum im Kopfdeckel im Vergleich zum Inneren der Ladephase sorgte für einen negativen Druckgradienten in der Platte der PDMS-Formen und verhinderte so die Blasenbildung in den MNP-Lösungen. Darüber hinaus wurde der Druckregler verwendet, um die Trocknungsstufe nach dem Trocknen automatisch wieder auf Atmosphärendruck zu bringen und die Vakuumkammer von der Beladungsstufe zu lösen.

Pflaster (n = 100) wurden mit dem MVP verteilt und getrocknet, um die Wirkung der flüssigen Formulierung auf die Pflasterabdeckung zu untersuchen, die durch unterschiedliche Trocknungsmuster auf einzelnen MNPs verursacht wird. Die flüssige Formulierung umfasste eine Polymerformulierung (PVP, PVA, PVP:PVA 1:1), gelöst zu 20 % (Gew./Gew.) in PBS und gemischt mit Farbstoff. Die Patch-Abdeckung wurde definiert als die Anzahl der erfolgreich gebildeten Mikronadeln nach dem Trocknen geteilt durch die Gesamtzahl der herstellbaren Patches (100). Die Pflasterabdeckung wurde für jedes Pflaster einzeln unter einem optischen Mikroskop für jede Formulierung quantifiziert. Tropfenfläche und Zirkularität wurden mittels Bildanalyse nach der Bildgebung quantifiziert.

Beim Laden von Impfstoffen und anderen biologischen Ladungen wurde ein zweistufiger Abgabeansatz verfolgt. Im ersten Schritt wurde die Impfstofflösung durch die Dosiernadeln (25 Gauge, BD Biosciences) in das Dosierrohr gesaugt. Die flüssige Formulierung im ersten Schritt bestand aus einer bestimmten Konzentration des biologischen Wirkstoffs gemischt mit PVP:PVA 1:1, 4 % (w/w). Anschließend wurden etwa 36 ± 6 µl Impfstofflösung (oder andere Ladungen) mit einem Paar 1-ml-Spritzen (BD Biosciences) in der Mitte der MNP-Formen auf dem Ausgabetablett verteilt. Zwischen der Abgabe jeweils zweier benachbarter MNPs wurde eine Zeitspanne von 9 s eingehalten, um den Impfstoffabfall beim Transfer des Abgaberoboters von Form zu Form zu minimieren. Die Trägerlösung (PVP:PVA 1:1, 20 % (w/w)) wurde direkt in eine neue Dosierspritze (10 ml-Größe, BD Biosciences) angesaugt. Eine Menge von 48 ± 6 µl der Trägerlösung wurde im zweiten Schritt direkt auf die zuvor verteilten (getrockneten) Impfstoffflecken aufgetragen. Vor und nach jeder Abgaberunde wurden die Nadeln und Röhrchen mit Ethanol (70 %) und anschließend mit sterilem Wasser gewaschen. In einigen Experimenten wurden zwei Ladungen gemeinsam abgegeben, sodass jede Spritze/Nadel eine andere Ladung abgab. In diesem Fall wurde das gleiche Lade-/Abgabeverfahren wie bei der Mono-Abgabe befolgt, mit der Ausnahme, dass jede Spritze mit einer anderen Ladung beladen wurde.

SolidWorks 2021 (Dassault Systèmes) wurde für 3D-Illustrationen des MVP, des Roboterarms, der Ausgabestation, der Vakuumgeräte, der Unterdruckkammer, des Behälters für sterile Umgebungen, des Wäscheständers, des Förderbands und der automatischen Entformungsstation für Mikronadel-Patches verwendet. Die Zeichnung des Epson T3-Roboterarms wurde direkt von der offiziellen Epson-Website heruntergeladen. Die XYZ-Plotter-, Wäscheständer- und Förderbandmodelle wurden von GrabCAD heruntergeladen. Alle anderen Teile wurden unter Berücksichtigung der tatsächlichen Abmessungen der Prototypenteile individuell entworfen.

Es wurde ein Design of Experiments (DOE)-Ansatz verfolgt, um die Auswirkung verschiedener Designparameter auf die kollektive Größe der Tropfen als Ausgabereaktion, die von der Roboterdüse (Nadel) auf ein einzelnes PDMS-Array abgegeben werden, systematisch zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde in einer Software (Minitab) ein L18-Orthogonal-Array-Versuchsplan (Taguchi DOE) erstellt. Die Auswirkung der folgenden Designparameter wurde untersucht: (1) Anbringung eines 0,2-µm-Filters an der Düse, (2) Nadelstärke, (3) Abgabehöhe, (4) Abgabedurchflussrate und (5) Polymerviskosität als Funktion der Polymerzusammensetzung. Die projizierte Tropfenfläche der Gesamttropfen am Ende jeder Abgabe wurde mit der ImageJ-Software quantifiziert. Die Ergebnisse (n = 3–5) wurden in Minitab analysiert, um die mittlere Reaktion der Tropfenfläche als Funktion der Änderung dieser Parameter zu ermitteln. Eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus ist in Extended Data Abb. 3g dargestellt. Das gesamte abgegebene Volumen wurde als konstant angesehen und betrug 200 µl. Unterschiedliche Flussraten wurden erreicht, indem das gesamte abgegebene Volumen konstant gehalten wurde (200 µl), aber die Abgabedauer variiert wurde.

MNPs wurden mit dem automatisierten MVP gedruckt und mit einem optischen Mikroskop abgebildet, um festzustellen, ob die Mikronadeln die volle Länge hatten und scharf waren (n = 30). Zur Schätzung der Nadelhöhe wurde eine Bildanalyse verwendet.

Rasterelektronenmikroskopie (REM) wurde verwendet, um hergestellte Mikronadeln abzubilden. Die Proben wurden zunächst mit einem Hummer 6.2 Sputtering System (ANATECH) mit einer dünnen Schicht Au/Pd beschichtet und dann mit einem JSM-5600LV SEM (JEOL) mit einer Beschleunigungsspannung von 5–10 kV abgebildet.

Aus Stahl-MNP-Positiven wurden Negativformen aus PDMS (Sylgard 184, Dow Corning) hergestellt, die gemäß den Anweisungen des Herstellers gemischt und über Nacht bei 60 °C ausgehärtet wurden. Um zusätzliche MNP-Positive zu erzeugen, wurde UV-härtbarer Norland Optical Adhesive 61 unter Verwendung einer Zentrifuge bei 3.234 g für 1 Minute in die PDMS-Negativformen gefüllt, 20 Minuten lang in einen UV-Härtungsofen bei Raumtemperatur gestellt und manuell entfernt.

Um eine Schale mit Negativformen zu erstellen, wurden MNP-Positive zunächst mithilfe eines lasergeschnittenen 5 × 5-Acrylgitters ausgerichtet. Anschließend wurde Norland Optical Adhesive 61 zwischen die einzelnen Harz-Positiv-Replikate gegossen, 20 Minuten lang bei Raumtemperatur UV-gehärtet und dann über Nacht bei 60 °C gehalten. Die resultierende Schale mit gleichmäßig verteilten 5 × 5 positiven MNPs (Extended Data Abb. 3d) wurde zur Herstellung einer 5 × 5 PDMS-Platte mit Negativformen (Extended Data Abb. 3e) verwendet. PDMS wurde verwendet, um die ausgerichteten Harzpositive abzudecken und eine zusätzliche 1 mm dicke PDMS-Schicht über den Positiven zu erzeugen. Das Blatt wurde geebnet, über Nacht bei 60 °C ausgehärtet und mit Isopropanol entfernt, um das Negativ vom Positiv zu trennen.

MNPs wurden hergestellt, indem 200 µl einer 20 % w/w PVP-, PVA- oder PVP:PVA-Lösung in eine PDMS-Form geladen und getrocknet wurden. Wenn Farbstoff, LNPs, DNA oder Protein in den MNP geladen wurden, wurde ein zweistufiges Ladeverfahren verwendet. Zuerst wurden 200 µl einer Lösung in entionisiertem (DI) Wasser oder PBS mit 0,8 mg, 1,6 mg, 2 mg oder 8 mg PVP:PVA und verschiedenen Mengen an LNPs (ausgedrückt als eingekapselte mRNA-Masse), Protein oder DNA geladen und getrocknet. Dann wurde eine variable Menge PVP:PVA 20 % w/w in entionisiertem Wasser oder PBS verwendet, um die gesamte MNP-Masse auf 40 mg PVP:PVA zu bringen. Diese Polymerlösung wurde geladen und getrocknet, um einen dünnen Polymerträger zu erzeugen. Alle in In-vivo-Studien verwendeten MNPs wurden, sofern nicht anders angegeben, durch manuelle Dosierung hergestellt. Alle mit LNPs, DNA oder Protein beladenen MNPs wurden durch Anlegen von Vakuum durch die Form unter Verwendung des Linienmusters bei –1 bar Überdruck und Anlegen von Vakuum in der Trockenkammer bei –0,6 bar Überdruck hergestellt.

Für die einstufige Herstellungsmethode wurden 40 mg PVP:PVA mit verschiedenen Proteinmengen gemischt und in einem Schritt hinzugefügt.

Die zum Laden von Tinte in die PDMS-Negativform benötigte Zeit wurde durch Aufzeichnung der Ladung mit einem Elektronenmikroskop (n = 3) bewertet. Das Mikroskop wurde an der Seite der PMDS-Form platziert und durch das transparente PDMS auf die Mikronadeln fokussiert.

Die Polymerlösung wurde in PDMS-Formen gefüllt, die unter verschiedenen Vakuumwerten von 0 bis –0,5 bar Überdruck für verschiedene Zeiträume entgast wurden. Die Zeitspanne zwischen Entgasung und Beladung wurde zwischen 5–10 Minuten und 1 Stunde variiert. Anschließend wurden die MNPs getrocknet und aus der PDMS-Form entfernt. Optische Bilder der Polymer-Farbstoff-Lösung, die sich in die PDMS-Form bewegt, wurden 0 Minuten, 2 Minuten, 5 Minuten und 10 Minuten nach Zugabe der Lösung in die Form aufgenommen. Aus diesen Bildern wurde die Nadelhöhe mittels Bildanalyse geschätzt.

Polymerlösungen (n = 1) wurden mit einem TA Instruments Discovery HR-2 Rheometer unter Verwendung einer 40-mm-Parallelplatte und einer Scherratenrampe von 0,01 s−1 bis 5.000 s−1 charakterisiert.

Nadeln eines mit 50 µg, 100 µg oder 200 µg BSA und 0,8 mg, 4 mg oder 8 mg PVP:PVA (für zweistufige Spitzenbeladung) beladenen MNP wurden geschnitten und in entionisiertem Wasser gelöst (n = 6). Ein Bicinchoninsäure-Assay (BCA) (Thermo Fisher Scientific) wurde verwendet, um die Proteinbeladung unter Verwendung des Standardverfahrens für eine 96-Well-Platte zu quantifizieren. Der Kalibrierungskurve wurde ein interner Standard aus PVP und PVA hinzugefügt, um deren Interferenz zu berücksichtigen. Die zur Kalibrierungskurve hinzugefügte Menge an PVP und PVA wurde auf der Grundlage des Nadelvolumens (0,08 mm3), einer Dichte von 1,2 g/cm3 und der Anzahl der für die BSA-Quantifizierung verwendeten Nadeln (angepasst an die Verdünnung) berechnet.

Für den Vergleich der Beladungseffizienz zwischen manueller und automatisierter Herstellung wurden Nadeln eines MNP, beladen mit 100 µg DNA und 1,6 mg PVP:PVA (zweistufige Spitzenbeladung), geschnitten und in Tris-EDTA (TE)-Puffer gelöst (n = 8). Die DNA wurde mittels UV-Absorption bei 260 nm und 280 nm mit einem NanoDrop quantifiziert. Da PVP auch im UV-Bereich absorbiert, wurde zur Kalibrierkurve die gleiche Menge PVP hinzugefügt, um dessen Beitrag zu berücksichtigen. Die hinzuzufügende PVP-Menge wurde auf die gleiche Weise berechnet wie bei der Proteinquantifizierung beschrieben und unter der Annahme eines PVP-zu-PVA-Verhältnisses von 1:1. Dies wurde für die Wärmekarte der Schalenposition und die Berechnung der Beladungseffizienz mit DNA wiederholt, jedoch wurden pro Pflaster 10 µg DNA und 2 mg PVP:PVA verwendet.

Gereinigte mRNAs wurden mit CleanCap AG-Kappe, vollständiger N1-Methylpseudouridin-Substitution und polyadenyliertem Schwanz (120 A) (TriLink BioTechnologies) erhalten. Für die LNP-Synthese wurden verschiedene hochreine Lipide verwendet, darunter 3,6-Bis({4-[bis(2-hydroxydodecyl)amino]butyl})piperazin-2,5-dion (cKK-E12, Organix), Heptadecan- 9-yl 8-((2-hydroxyethyl)(8-nonyloxy)-8-oxoctyl)amino)octanoat (Lipid 5, Organix), 1-2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE, Avanti), Cholesterin (Sigma-Aldrich) und 1-2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-2000] (Ammoniumsalz) (C14-PEG2000, Avanti). LNPs wurden unter Verwendung der zuvor beschriebenen Verfahren34,35,36 hergestellt. Lipide wurden in Ethanol in einem Molverhältnis von 35:16:46,5:2,5 cKK-E12:DOPE:Cholesterin:C14-PEG2000 oder 38,4:12,3:47,4:1,9 Lipid 5:DOPE:Cholesterin:C14-PEG2000 bei Verwendung von cKK- gelöst. E12 bzw. Lipid 5 als ionisierbares Lipid. Um die LNPs herzustellen, wurde die ethanolische Lösung schnell zu einer mit Citrat gepufferten mRNA-Lösung bei pH 3 im Volumenverhältnis 3:1 (wässrig:Ethanol) gegeben und mit dieser gemischt. Bei Verwendung von cKKe12 wurde das Gewichtsverhältnis von ionisierbarem Lipid zu mRNA auf 10 eingestellt und die endgültige mRNA-Konzentration betrug 0,1 mg ml−1. Bei Verwendung von Lipid 5 wurde das Gewichtsverhältnis von ionisierbarem Lipid zu mRNA auf 5 eingestellt und die endgültige mRNA-Konzentration betrug 0,135 mg ml−1. Alle Nukleinsäuren wurden bei –80 °C gelagert und vor der Verwendung auf Eis aufgetaut. Die LNPs wurden dann mindestens 2 Stunden lang in PBS bei 4 °C in einer Kassette mit einem Molekulargewichts-Cutoff (MWCO) von 20.000 dialysiert34. Für LNPs in entionisiertem Wasser wurde die Lösung für mindestens weitere 2 Stunden bei 4 °C gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Bei Bedarf wurden die LNPs durch Zentrifugieren bei 3.000 g42 auf einem Amicon-Filter konzentriert. Alle Lösungen wurden bei 4 °C aufbewahrt und innerhalb einer Woche verbraucht.

Die mRNA-Konzentration und die Einkapselungseffizienz in den LNPs wurden mit einem Quant-iT RiboGreen-Assay (Thermo Fisher Scientific) unter Verwendung eines an anderer Stelle beschriebenen modifizierten Verfahrens geschätzt (n = 3 pro Charge)34. Kurz gesagt, LNPs wurden entweder in TE oder TE gemischt mit Triton X-100-Puffer (TX) verdünnt. Anschließend wurde der Quant-iT RiboGreen-Assay verwendet, um die nicht eingekapselte mRNA (bei Verdünnung mit TE) und die Gesamt-mRNA-Konzentration (bei Verdünnung mit TX) zu quantifizieren. Zur Größenbestimmung wurden die LNPs 200-fach in PBS verdünnt und mit einem Zetasizer Nano-NS (Malvern Instruments) charakterisiert. Bei der Messung der mRNA-Beladung in MNPs wurden Mikronadeln geschnitten und in TE und TX gelöst. Bei der Messung der im MNP-Träger beladenen mRNA wurden die Mikronadeln geschnitten und das verbleibende MNP in TE und TX gelöst. Durch Subtrahieren der nicht eingekapselten mRNA von der Gesamt-mRNA erhielt man die Konzentration der eingekapselten mRNA.

Die Polymere wurden je nach Löslichkeit (n = 4) in PBS- oder DI-Wasser in einer Konzentration von 10 bis 30 Gew.-% gelöst. Diese Lösungen wurden dann abgewogen und mit der LNP-Suspension gemischt, um das geeignete Polymer-zu-mRNA-Massenverhältnis zu erreichen. Die Tintenmischung wurde sofort in einem LoBind Eppendorf-Röhrchen in einem Exsikkator unter –0,5 bar Vakuum getrocknet. Nach 24-stündiger Trocknung wurde das Tintenpellet erneut in PBS aufgelöst und 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Mit PBS wurde das Volumen so eingestellt, dass 15 µl gelöste Tinte 50 ng eingekapselte mRNA enthalten. Diese Mischung wurde zur Transfektion von Zellen verwendet. Das verwendete ionisierbare Lipid war cKK-E12.

Für die In-vitro-Bewertung von mit LNPs beladenen MNPs wurden vier MNPs unter Verwendung der zweistufigen Beladung, 10 µg mRNA und 8 mg PVP:PVA für die Spitzenbeladung, hergestellt. Zwei MNPs wurden zur Quantifizierung der LNP-Spitzenbeladung und zwei MNPs zur Transfektion von HeLa-Zellen verwendet. Die Nadeln wurden geschnitten und für die RNA-Quantifizierung in 1 ml TE-Puffer und für die Zelltransfektion in 1 ml DMEM gelöst. Das in der LNP-Synthese beschriebene Verfahren wurde zur Quantifizierung der mRNA verwendet und HeLa-Zellen wurden wie nachstehend beschrieben transfiziert. Das verwendete ionisierbare Lipid war Lipid 5.

HeLa-Zellen wurden in DMEM mit hohem Glucosegehalt mit Phenolrot (Invitrogen), ergänzt mit 10 % FBS (Invitrogen) und 1 % Antibiotikum (Invitrogen), kultiviert. Anschließend wurden 10.000 Zellen in die Vertiefungen einer weißen Platte mit 96 Vertiefungen in vollem Wachstumsmedium ausgesät. Zwanzig Stunden nach der Aussaat wurden dem Wachstumsmedium 15 µl frische LNPs oder gelöste Formulierung oder 50 µl frische LNPs oder gelöste MNPs zugesetzt. In allen Fällen wurden jeder Vertiefung 50 ng eingekapselte mRNA zugesetzt. Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion wurden 100 µl Bright-Glo Luciferase Assay Kit (Promega)-Reagens hinzugefügt und die Lumineszenz wurde in den folgenden 2 Minuten mit einem Tecan Infinite 200 PRO-Plattenlesegerät gemessen.

Die Lebensfähigkeit von HeLa-Zellen wurde in Gegenwart von 0,6 mg Polymerformulierung und 50 ng mRNA, eingekapselt in LNPs, hergestellt mit cKK-e12 als ionisierbarem Lipid, gemessen. In jeder Vertiefung wurden 15 Mikroliter Tinte verwendet. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde in einer 96-Well-Platte unter Verwendung eines CKK8-Assays gemessen, wie vom Hersteller beschrieben (ab228554).

Das MNP wurde mithilfe der zweistufigen Beladung hergestellt, wobei im ersten Schritt 10 µg mRNA und 8 mg PVP:PVA verwendet wurden. Jede der 100 Nadeln des MNP wurde unter einem Mikroskop manuell an ihrer Basis geschnitten und anhand ihrer Position auf dem Array sortiert. Die RNA wurde auf die gleiche Weise quantifiziert, wie im Abschnitt zur LNP-Synthese beschrieben. Das verwendete ionisierbare Lipid war Lipid 5.

Für alle Proben wurden FLuc-mRNA-LNPs verwendet. LNPs wurden analysiert (1) nach Dialyse zu PBS, (2) nach Konzentrierung auf 320 μg ml-1, (3) nach Verdünnung auf 200 μg ml-1 in 4 % w/w Polymerlösung zur Bildung von Impfstofftinte und (4) nach dem Trocknen zu MNPs. Die Proben wurden in 20 µl gelöst, 2 s lang gevortext, mit weiteren 200 µl verdünnt und gemischt. Anschließend wurden 10 µl der rekonstituierten mRNA-LNPs in 490 µl Wasser verdünnt, 2 s lang verwirbelt und dann mithilfe dynamischer Lichtstreuung (DLS) auf einem Zetasizer Nano-NS (Malvern Instruments) analysiert. Proben (n = 5 pro Gruppe) wurden vor der Messung 60 s lang äquilibriert. Für jede Probe wurden drei technische Wiederholungen durchgeführt.

Für alle Proben wurden FLuc-mRNA-LNPs verwendet. LNPs wurden analysiert (1) nach Dialyse zu PBS (2), nach Konzentration auf 320 μg ml-1 (3), nach Verdünnung auf 200 μg ml-1 in 4 % w/w Polymerlösung zur Bildung von Impfstofftinte und (4) nach dem Trocknen zu MNPs. Aufgelöste Proben wurden auf die kohlenstoffbeschichteten Kupfer-TEM-Gitter gegeben und abgetupft, um die überschüssige Lösung zu entfernen. Als nächstes wurden die Proben mit 1 %iger wässriger Phosphorwolframsäurelösung gefärbt; die überschüssige Färbelösung wurde entfernt; und die Proben wurden vor der TEM-Bildgebung bei Raumtemperatur getrocknet. Für die kryogene TEM-Bildgebung wurden die Proben mit einem 930 Gatan Cryoplunge 3 tauchgefroren. Alle Proben wurden mit einem JEOL 2100 FEG-Mikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV abgebildet.

Für alle Proben wurden FLuc-mRNA-LNPs verwendet. mRNA wurde analysiert (1) wie vom Hersteller bereitgestellt, (2) nach mRNA-LNP-Synthese und Dialyse zu PBS, (3) nach Verdünnung auf 200 μg ml−1 in 4 % w/w Polymerlösung zur Bildung von Impfstofftinte und ( 4) nach dem Trocknen zur Bildung von MNPs. Anschließend wurden 2 µl der gelösten Proben mit einem Agilent Femto Pulse und dem Ultra Sensitivity RNA Kit (FP-1201) analysiert. Die Proben wurden mit TE- oder TX-Puffer vorbereitet.

Der Wassergehalt der hergestellten MNPs zu verschiedenen Zeitpunkten und Trocknungsstadien wurde durch thermogravimetrische Analyse (TGA) unter Verwendung eines thermogravimetrischen Analysators Pyris 1 (PerkinElmer) mit einer Heizrate von 20 °C pro Minute von 50 °C auf 600 °C quantifiziert Stickstofffluss (20 ml min−1) (n = 3). Der Wassergehalt wurde bewertet, indem nur die Nadeln der in Keramikpfannen platzierten MNPs und nicht die Unterlage analysiert wurden. Die Trocknungsgeschwindigkeit wurde anhand einer linearen Regression des über die Zeit während des Trocknungsprozesses gemessenen Wassergehalts geschätzt. Alle Analysen wurden dreifach durchgeführt.

Für den Kompressionstest wurde ein einzelner MNP zwischen Kompressionsplatten (Instron 2501-Serie) montiert und mit einer Geschwindigkeit von 1 mm min−1 unter Verwendung eines Instron 5943 mit einer 500 N-Lastzelle (n = 10) komprimiert. Es wurden die Spitzenkraft vor dem Versagen der Mikronadel und die Steigung des linearen Bereichs der anfänglichen Kompression angegeben. Der Fehlermodus der Mikronadel wurde durch Bildgebung der Patches nach dem Test bestimmt.

MNPs wurden ex vivo mit einem Mini-Federapplikator (Micropoint Technologies) 2 Minuten, 5 Minuten, 10 Minuten oder 30 Minuten lang (n = 3) auf exzidierte Schweinehaut aufgetragen. Anschließend wurden die Hautproben 48 Stunden lang in Formalin fixiert und dann in 70 %iges Ethanol überführt und in Paraffinwachs eingebettet. Die Proben wurden geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt.

Um die Mikronadelauflösung als Funktion der Anwendungszeit zu quantifizieren, wurden Mikronadelpflaster vor und nach der Anwendung auf exzidierter Schweinehaut mit einem Leica DFC450 abgebildet. Die Patches wurden zur Bildgebung mit der LAS-Software Version 4.7 quer platziert. Die Mikronadellänge wurde mit ImageJ für mindestens 10 Mikronadeln von jedem Pflaster berechnet und diese Messungen wurden an drei Pflastern pro Zeitpunkt durchgeführt.

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des Massachusetts Institute of Technology Committee on Animal Care (1019-061-22) genehmigt und durchgeführt. Sechs bis acht Wochen alte weibliche C57BL/6-Mäuse (Charles River Laboratories) wurden verwendet und auf Sicherheit überwacht (n = 5). MNPs wurden mit mRNA-LNPs, die für FLuc (L-7010, TriLink BioTechnologies) kodieren, unter Verwendung der oben beschriebenen zweistufigen Lademethode hergestellt. Die LNP-Dosis und die Chemie der ionisierbaren Lipide wurden variiert, wobei ein Polymer:mRNA-Massenverhältnis von mindestens 100:1 aufrechterhalten wurde. Es wurden zwei ionisierbare Lipide untersucht, die zuvor für IV- oder IM-mRNA-Verabreichungsmethoden ausgewählt wurden: cKK-E12 (Ref. 34) und Lipid 5 (Ref. 35). MNPs wurden unter Narkose auf beide Fußballen aufgetragen. Um die gesamte in einem MNP enthaltene LNP-Dosis vollständiger aufzulösen, wurden die MNPs bei Anwendung eines 10 × 10-Arrays in zwei Hälften geteilt und nacheinander 10 Minuten pro Hälfte auf dasselbe Fußpolster aufgetragen. In der ersten Minute wurde Handdruck ausgeübt, und dann wurde der MNP für die restlichen 9 Minuten mit Klebeband am Fußpolster befestigt. Als Positivkontrolle wurden LNPs als 40-µl-Suspension in PBS in passenden Dosen an den kaudalen Oberschenkelmuskel verabreicht. Das Fußpolster wurde ausgewählt, weil es zuvor für die IVIS-Bildgebung der Lumineszenz nach Mikronadelanwendung verwendet wurde37 und weil es sich um eine gut untersuchte Stelle für die ID-Verabreichung von Impfstoffen handelt, die die Isolierung des dränierenden Lymphknotens ermöglicht62,63.

Vierundzwanzig Stunden nach der MNP-Anwendung wurden Mäuse in einem kinetischen IVIS-Bildgebungssystem (PerkinElmer) auf Biolumineszenz abgebildet. Dann wurde den Mäusen 15 Minuten vor der Bildgebung intraperitoneal RediJect D-Luciferin Ultra (PerkinElmer) in einer Menge von 150 mg kg-1 injiziert. Die Lumineszenz wurde mit der LivingImage-Software (PerkinElmer) quantifiziert. Der Vergleich zwischen Lumineszenzergebnissen muss sorgfältig abgewogen werden, da die Lichtabsorption, -streuung und -abgabetiefe an der Injektionsstelle das mit IVIS gemessene Signal beeinflussen kann. Für das Kinetikexperiment wurde die Bildgebung 2 Stunden, 6 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach der Verabreichung durchgeführt.

Insgesamt wurden 89.000 HEK293-Zellen pro Vertiefung eines BioCoat Poly-D-Lysin-Kulturobjektträgers mit vier Vertiefungen (354577) ausgesät. Es wurde das gleiche Wachstumsmedium wie für HeLa-Zellen verwendet. Vierundzwanzig Stunden nach der Aussaat wurden die Zellen mit 265 ng mRNA pro Vertiefung aus einer LNP-Suspension transfiziert, die mit Lipid 5 hergestellt wurde und mRNA einkapselte, die für RBD kodiert. Aus einem MNP gelöste LNPs wurden auch verwendet, um die Bioaktivität nach dem Laden in MNPs zu demonstrieren. Es wurden die gleichen MNPs verwendet, die auch in der SARS-CoV-2-Impfstudie verwendet wurden. Die Nadeln wurden geschnitten, in DMEM gelöst und zur Transfektion von Zellen unter Verwendung der gleichen mRNA-Masse wie die Kontroll-LNP-Suspension verwendet. Die mRNA wurde quantifiziert, indem Nadeln eines unabhängigen Replikats des MNP in TE-Puffer aufgelöst und das in der LNP-Synthese beschriebene Verfahren verwendet wurden (PVP und PVA wurden auch als interne Standards zur RNA-Kalibrierungskurve des RiboGreen hinzugefügt). Achtundvierzig Stunden nach der Aussaat wurden die Zellen zweimal mit PBS bei 37 °C gewaschen. Zwischen allen nachfolgenden Schritten wurden die Zellen mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden 15 Minuten lang auf Raumtemperatur gebracht, um sich zu äquilibrieren. Dann wurde 1 ml Image-iT-Fixierlösung (Invitrogen) pro Vertiefung (FB002) hinzugefügt und 15 Minuten stehen gelassen. Als nächstes wurde 1 ml eBioscience Intrazellulärer Fixierungs- und Permeabilisierungspuffer (Invitrogen) hinzugefügt und 10 Minuten lang inkubiert. Dann wurde 1 ml BSA 1 % (w:v) in PBS 1 Stunde lang bei Raumtemperatur zugegeben. Dann wurden 300 µl des rekombinanten humanen monoklonalen Antikörpers SARS-CoV-2 Spike Protein (RBD) (T01KHu, Thermo Fisher Scientific, 703958), 100-fach verdünnt in PBS, in jede Vertiefung gegeben und 1 Stunde lang inkubiert. PBS-Tween wurde zum Waschen der Zellen verwendet. Als nächstes wurden 300 µl kreuzadsorbierter Ziegen-Anti-Human-IgG (H+L)-Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific, A-11013), 400-fach in PBS verdünnt, als Sekundärantikörper verwendet und 1 Jahr lang inkubiert H. Anschließend wurden 300 µl Rhodamin-Phalloidin-Färbung (Invitrogen R415), 400-fach in 1 % BSA verdünnt, für die Bildgebung des zellulären Zytoskeletts verwendet und 30 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden schließlich mit einem Tropfen DAPI ProLong (Invitrogen, P36982) fixiert. Die Zellen wurden auf einem konfokalen Mikroskop (Olympus FV1000) abgebildet.

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des Massachusetts Institute of Technology Committee on Animal Care (1019-061-22) genehmigt und durchgeführt. Sechs bis acht Wochen alte weibliche C57BL/6-Mäuse (Charles River Laboratories) wurden verwendet und auf Sicherheit überwacht (n = 5). MNPs wurden mit humanen Codon-optimierten mRNA-LNPs, die für SARS-CoV-2 RBD und ein T4-Trimerisierungsmotiv kodieren, unter Verwendung der oben beschriebenen zweistufigen Lademethode hergestellt. Es wurden kleinere MNP-Arrays hergestellt, die 1,5 µg eingekapselte mRNA enthielten, was durch mRNA-Quantifizierung verifiziert wurde. Vier MNPs mit etwa 12 Mikronadeln wurden auf das linke und rechte Fußballen von Mäusen unter Anästhesie aufgetragen, wobei die Anwendungszeit jeweils 10 Minuten betrug, was einer Gesamtdosis von verkapselter mRNA von 6,0 µg pro Maus entspricht. In der ersten Minute wurde Handdruck ausgeübt, und dann wurde der MNP für die restlichen 9 Minuten mit Klebeband am Fußpolster befestigt. Als Positivkontrolle wurden LNPs als 40-µl-Suspension in PBS mit 10,0 µg eingekapselter mRNA pro Maus in den rechten Schwanzmuskel des Oberschenkels verabreicht.

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des Massachusetts Institute of Technology Committee on Animal Care (1019-061-22) genehmigt und durchgeführt. MNPs wurden mit FLuc-mRNA-LNPs unter Verwendung der oben beschriebenen zweistufigen Lademethode mit einer mRNA-Dosis von 1,0 µg pro Pflaster und einem Polymer:mRNA-Massenverhältnis von 500:1 hergestellt. Als ionisierbares Lipid wurde Lipid 5 verwendet. MNP-Größe und -Anwendung sind identisch mit den obigen Studien zur fLuc-Expression (n = 5). MNPs wurden in einem Behälter mit Silica-Trockenmittel bei verschiedenen Temperaturen gelagert. Als Positivkontrolle wurden versiegelte Fläschchen mit Suspension, die die gleiche Menge an fLuc-mRNA in mit Lipid 5 hergestellten LNPs enthielten, bei verschiedenen Temperaturen neben MNPs gelagert.

Es wurde ein SARS-CoV-2 Spike S1-RBD ELISA-Nachweiskit verwendet (L00845, GenScript). Die Platten wurden mit gereinigtem rekombinantem SARS-CoV-2 Spike S1-RBD-Antigen beschichtet. Die Platten wurden mit Reihenverdünnungen hitzeinaktivierter Seren inkubiert und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Als Sekundärantikörper wurde eine 1:10.000-Verdünnung des Kaninchen-Anti-Maus-IgG-Meerrettich-Peroxidase-Konjugats (Abcam, ab6728) und als Substrat 3,5,3′,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) verwendet. Interpolierte Endpunkttiter wurden als die Verdünnung berechnet, die eine optische Dichte emittierte, die das Dreifache des Hintergrunds überstieg, der durch Serum von naiven Mäusen erzeugt wurde.

ECLA-Platten (Meso Scale Discovery SARS-CoV-2 IgG, N05CA-1, Panel 7) wurden mit vier Antigen-Spots in jeder Vertiefung entworfen und hergestellt. Die enthaltenen Antigene waren WA1/2020, B.1.1.7, P.1 und B.1.351 S1-RBD. Die Platten wurden mit 50 µl 1 % BSA-Lösung für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 700 U/min blockiert. Während des Blockierens wurde das Serum 1:5.000 mit Diluent 100 (Meso Scale Discovery) verdünnt. Die Platten wurden mit 150 µl Waschpuffer gewaschen und trockengetupft, und 50 µl verdünnte Proben wurden in zweifacher Ausfertigung zu den Platten gegeben. Die Proben wurden bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 700 U/min 2 Stunden lang inkubiert. Der Sekundärantikörper wurde unter Verwendung des Kaninchen-Anti-Maus-IgG-Nachweisantikörpers (315-005-045) von Jackson ImmunoResearch hergestellt, der durch NHS-Ester-Chemie gemäß den Richtlinien des Herstellers (R91AO-1) an den MSD GOLD SULFO-TAG konjugiert war. Die Platten wurden erneut dreimal gewaschen und 50 µl SULFO-markierter Anti-Maus-IgG-Nachweisantikörper, 1-fach verdünnt in Verdünnungsmittel 100, in jede Vertiefung gegeben und 1 Stunde lang unter Schütteln bei 700 U/min inkubiert. Die Teller wurden dreimal gewaschen; 150 µl MSD GOLD Read Buffer B wurden in jede Vertiefung gegeben; und die Platten wurden auf einem MESO Quick-Plex SQ 120 abgelesen. MSD-Titer für jede Probe wurden als relative Lichteinheiten (RLU) angegeben, die als Probe minus Leerwert für jeden Spot und jede Probe berechnet wurden. Die Nachweisgrenze wurde für alle Tests auf 500 RLU festgelegt.

MNPs mit 1,5 μg eingekapselter SARS-CoV-2-mRNA wurden in einem Behälter mit Silica-Trockenmittel bei verschiedenen Temperaturen gelagert. Als Positivkontrolle wurden versiegelte Fläschchen mit Suspension, die SARS-CoV-2-mRNA-LNPs in einer Menge von 200 µg ml−1 enthielten, bei verschiedenen Temperaturen zusammen mit MNPs gelagert. Sechs bis acht Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse (Charles River Laboratories) wurden verwendet und auf Sicherheit überwacht (n = 5). Alle Mäuse erhielten eine Primärdosis von 10 µg eingekapselter mRNA in mRNA-LNPs, die als 40 µl Suspension in PBS in den rechten Schwanzmuskel des Oberschenkels verabreicht wurde. Anschließend wurden die Mäuse mit verschiedenen Materialien geboostet, einschließlich frischer Kontrollen und Pflastern oder Suspensionen, die einen oder drei Monate lang gelagert wurden. Für MNP-Gruppen wurden, wie in früheren Experimenten, vier MNPs mit 12 Mikronadeln auf das linke und rechte Fußpolster von Mäusen mit Anästhesie aufgetragen, wobei die Anwendungszeit jeweils 10 Minuten betrug, was einer geschätzten mRNA-Gesamtdosis von 6,0 µg pro Maus entspricht. Für IM-Gruppen wurden 4 μg eingekapselte mRNA in mRNA-LNPs als 40 μl Suspension in PBS in den rechten kaudalen Oberschenkelmuskel verabreicht.

Statistische Analysen wurden mit der GraphPad Prism-Software durchgeführt. P-Werte werden dargestellt durch: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die im Rahmen dieser Studien generierten und analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich. Die für diese Studie verwendete RBD-Sequenz ist bei GenBank verfügbar (OP839194).

Die für die Durchsatzmodellierung und Geräteprogrammierung verwendeten Codes sind in einem öffentlichen Zenodo-Repository verfügbar (https://doi.org/10.5281/zenodo.7735167).

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Referenzen herunterladen

Wir danken Meso Scale Discovery für großzügige Beratung, Unterstützung und Reagenzien. Wir danken dem Robert A. Swanson (1969) Biotechnology Center (RRID: SCR_018674) des Koch-Instituts für technische Unterstützung, insbesondere dem Histology Core, dem Nanotechnology Materials Core, dem BioMicroCenter und den Animal Imaging and Preclinical Testing Facilities. Wir danken dem Lab for Engineering Materials am MIT Department of Materials Science and Engineering für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise durch den Koch Institute Support (core) Grant P30-CA14051 des National Cancer Institute unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch den Zuschuss DHHS/OS/ASPR/BARDA/DRIVe EZ-BAA-18-100-SOL-00018 der Biomedical Advanced Research and Development Authority (BARDA) unterstützt. AVS ist Stipendiat und möchte der Belgian American Educational Foundation (BAEF) und Wallonia-Brussels International für das Excellence Scholarship (WBI.World) danken. MK ist Stipendiat und möchte der Bodossaki Foundation und der Onassis Foundation danken. Wir danken LHT für die Unterstützung der National Institutes of Health (T32 AI0073787).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Aurélien vander Straeten, Morteza Sarmadi, John L. Daristoteles.

David H. Koch Institut für integrative Krebsforschung, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Aurélien vander Straeten, Morteza Sarmadi, John L. Daristoteles, Maria Kanelli, Joe Collins, Apurva Pardeshi, Jooli Han, Dhruv Varshney, Behnaz Eshaghi, Johnny Garcia, Timothy A. Forster, Gary Li, Nandita Menon, Shahad K. Alsaiari, Robert Langer & Ana Jaklenec

Zentrum für Virologie und Impfstoffforschung, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Lisa H. Tostanoski, Catherine Jacob-Dolan, Olivia C. Powers, Kevin Hall und Dan H. Barouch

Abteilung für Chemieingenieurwesen, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Sydney L. Pyon, Linzixuan Zhang und Robert Langer

Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Catherine Jacob-Dolan und Dan H. Barouch

Ragon Institute of MGH, MIT und Harvard, Cambridge, MA, USA

Catherine Jacob-Dolan und Dan H. Barouch

Labor für Makromolekulartechnik, Departement Maschinenbau und Verfahrenstechnik, ETH Zürich, Zürich, Schweiz

Morris Wolf & Mark W. Tibbitt

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Konzeptualisierung: AVS, MS, JD, MK, JC, AJ und RF Methodik: AVS, MS, JD, MK, LT, JC, AP, DV, BE, JG, TF, GL, NM, CJD, SL, LZ, OP , KH, SA und MW Untersuchung: AVS, MS, JD, MK, LT, JC, AP, DV, BE, JG, TF, GL, NM, SP, CJD, SL, LZ, OP, KH und MW Visualisierung: AVS , MS, JD und JH Finanzierungseinwerbung: AJ, RL, AVS und MK Projektverwaltung: AVS, JD, JC und AJ Aufsicht: AJ, RL, DB und MT Schreiben – Originalentwurf: AVS, MS und JD Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung : AVS, MS, JD, LT, JH, RF, DB, RL und AJ

Korrespondenz mit Robert Langer oder Ana Jaklenec.

Eine Liste der Unternehmen, an denen RL beteiligt ist, egal ob entschädigt oder nicht, finden Sie unter www.dropbox.com/s/yc3xqb5s8s94v7x/Rev Langer COI.pdf?dl=0. Eine Liste der Unternehmen, an denen AJ mit oder ohne Vergütung beteiligt ist, finden Sie unter https://www.dropbox.com/s/wre16lh7jr7bvoi/230410%20Jaklenec%20COI.pdf?dl=0. AVS, MS, JD, MK, JC, RL und AJ werden in einer anhängigen Patentanmeldung (17/903586) im Zusammenhang mit der beschriebenen Technologie als Erfinder genannt. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Biotechnology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Unabhängiger Berater: Robert Farra.

(a) Laden in die negative Mikronadelform basierend auf der PDMS-Luftdurchlässigkeit, gefolgt vom Trocknen der Polymerlösung. Unter der PDMS-Folie wird Vakuum angelegt, um durch die luftdurchlässige PDMS-Form Luft aus der Impfstofftinte zu entfernen. Das Trocknen wird beschleunigt, indem auch über der Form Vakuum angelegt wird. (b) Laden in die negative Mikronadelform basierend auf der PDMS-Luftlöslichkeit, gefolgt vom Trocknen der Polymerlösung. (c) Vakuumgerätekonfigurationen zum Anlegen von Vakuum an den Boden der PDMS-Form. (d) Ladezeit der Polymerlösung für PDMS, hergestellt aus unterschiedlichen Polymer-Vernetzer-Verhältnissen (n = 3 unabhängige Proben). Es wurde eine gewöhnliche einfaktorielle ANOVA (Sidaks Mehrfachvergleichstest) verwendet. (e) Bilder von MNPs aus PDMS-Formen, die unter verschiedenen Vakuumwerten entgast und mit Polymerlösung beladen wurden. (f) Bilder von MNPs, bei denen die Polymerlösung nach 5–10 Minuten oder 1 Stunde in die entgaste PDMS-Form gegeben wurde. (g–h) Verlauf der Nadelhöhe über die Zeit nach der Abgabe der Polymerlösung (n = 13–18 einzelne Nadeln). (i–j) Normalisierte Nadelhöhe aus Bildern nach verschiedenen Entgasungsbedingungen (n = 10–18 einzelne Nadeln). (k) Viskosität gemessen für verschiedene in dieser Studie verwendete Polymerlösungen (n = 1). Die Daten stellen Mittelwerte ± Standardabweichung dar. P-Werte werden dargestellt durch: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. MPa, Megapascal; NS, nicht signifikant.

(a) Bilder von MNPs, die aus verschiedenen Volumina einer 20 % w/w PVP:PVA-Lösung hergestellt wurden und die Impfstoffverschwendung durch einen ultradünnen Träger minimieren. Die 20 % w/w PVP:PVA-Lösungen wurden mit Kristallviolett gefärbt. (b–c) Bilder zur Optimierung des Abgabevolumens und Messung der Rundheit des getrockneten Trägers resultierten aus verschiedenen MNP-Matrixformulierungen (n = 1).

(a) CAD-Design der Acrylteile, die geschnitten und zusammengefügt wurden, um die Ladestation zu bilden. Bilder von (b) der Ladestation, (c) der Kopfabdeckung der Trocknungsstation, (d) der 5×5 MNP-Positivform und (e) der 5×5 PDMS-Platte mit negativen MNP-Formen. (f) Ein Foto des MVP-Systems mit kommentierten Funktionen. (g) Schematische Darstellung des Ausgabesystems und der Ausgabehöhe. Einfluss der Dosierparameter Durchflussrate (h), Filtration (i), Nadelgröße (j) und Dosierhöhe (k) auf die resultierende Tropfengröße. Alle Unterschiede sind bei (P < 0,01) signifikant, sofern nicht anders angegeben. Es wurde eine gewöhnliche einfaktorielle ANOVA (Sidaks Mehrfachvergleichstest) verwendet (n = 3 MNPs pro Gruppe). (l) Ein Bild von 100 MNPs, die auf einem Druckfach verteilt und getrocknet wurden. Die Daten stellen einen Mittelwert ± SD *P ≤ 0,05 dar; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. NS, nicht signifikant.

(a) Schematische Darstellung der Prozesse, die für (a) einstufiges Laden und (b) zweistufiges Spitzenladen verwendet werden. Eine Lösung, die den Impfstoff und das Polymer enthält, wird zunächst mithilfe eines Roboterarms über der PDMS-Form abgegeben. Gleichzeitig wird unten ein Vakuum von –1 bar angelegt, um die Lösung in die Negativform zu füllen. Anschließend wird die Lösung unter einer Trockenmittelatmosphäre und einem Vakuum von –0,6 bar getrocknet. Bei der einstufigen Beladung (a) werden Impfstoff und genügend Polymer zur Bildung von Spitzen und Träger in einem Schritt aufgetragen. Bei der zweistufigen Spitzenbeladung (b) werden Impfstoff und Polymer zunächst nur in den Spitzen abgelagert, und dann wird das gleiche Verfahren wiederholt, wobei nur das Polymer verwendet wird, um den Träger der MNPs zu bilden. (c) Charakterisierung korrekt geformter, scharfer Mikronadeln voller Länge, die vom automatisierten MVP hergestellt wurden, als Prozentsatz der insgesamt produzierten Nadeln (n = 30 Patches). Die hergestellten MNPs hatten durchschnittlich 37 ± 8 Nadeln pro Pflaster. (d) Der Abgabedurchsatz ist eine Funktion der Höhe des abgegebenen Tropfens und der Größe des Pflasters, während (e) der Trocknungsdurchsatz eine Funktion der Trocknungszeit und der Anzahl der Nadeln pro Pflaster ist. Beide Durchsätze sind Funktionen von (f) Trocknungszeit und (g) Patchgröße. Der Schritt mit dem niedrigsten Durchsatz bestimmt den Gesamtdurchsatz des Mikronadel-Impfstoffdruckers.

(a) Der Durchsatz der automatisierten MNP-Herstellung kann durch modulares Verschieben von Tabletts mit MNP-Formen auf ein Trockengestell erhöht werden, um den Trocknungsschritt des Impfstoffs zu beschleunigen. Die Vakuumanwendung zum Befüllen der Mikronadelform kann entweder auf der Formtransportvorrichtung (Mitte) oder im Tablettgestell (rechts) erfolgen. (b) Der Trocknungsdurchsatz wird als Funktion der Schalenlänge und der Anzahl der Schalen im vertikalen Trockengestell dargestellt. Die Größe (h) des Trockengestells wurde unter der Annahme einer einzelnen Tabletthöhe von 50 mm geschätzt. Die Trocknungszeit wird wie beim Einzelschalengerät mit 48 Stunden angenommen. (c) PDMS-Formen können vor der Impfstoffabgabe mit einer Entgasungstechnik unter Verwendung von Unterdruck vorbehandelt werden, um einen beschleunigten MNP-Herstellungsprozess zu ermöglichen. Mit entgasten PDMS-Formen kann ein Roboterarm kontinuierlich Impfstofflösung abgeben. Vollständig ausgegebene PDMS-Formen können dann mithilfe eines Förderbands zu einem Trockengestell transportiert werden. Der gesamte Prozess wird in einem aseptischen Gehäuse durchgeführt, um die Sterilität während der Verarbeitung aufrechtzuerhalten. (d–i) Design für die automatisierte Patch-Entformung. (d) Nachdem die Impfstoff-Mikronadelpflaster in einer PDMS-Form vollständig getrocknet sind, (e) bringt ein Roboterarm eine Acrylunterlage mit doppelseitigem Klebeband. (f) Der Roboterarm richtet die Acrylklebstoffrückseite aus und befestigt sie an einem Mikronadelpflaster. (g) Das MNP wird aus der PDMS-Form entfernt, während der Roboterarm vertikal angehoben wird. (h) Die Spitze des Roboterarms tritt zwischen einen Metallschlitz ein, der für die MNP-Entfernung vorgesehen ist. Wenn sich der Roboterarm vertikal anhebt, löst sich der MNP von der Roboterarmspitze und fällt in seine Verpackung (i), wo der MNP schwebt, um jeden direkten Kontakt mit den Nadelspitzen zu verhindern. Entformte MNPs werden verpackt und bis zur Verwendung in einer sterilen und trockenen Umgebung gelagert.

Vergleich der Spitzenbeladung (a) und der Spitzenbeladungseffizienz (b) unter Verwendung des einstufigen oder zweistufigen Herstellungsprozesses als Funktion der für die Dosierung verwendeten Proteinmasse. (c) Vergleich der verwendeten Polymermasse (PVP:PVA) mit dem Protein (BSA) während des ersten Schritts des zweistufigen Herstellungsprozesses. Die niedrige Polymermasse beträgt 0,8 mg PVP:PVA, während die hohe Polymermasse 4 mg bzw. 8 mg PVP:PVA für 100 µg bzw. 200 µg BSA beträgt. Es wurde eine gewöhnliche Zwei-Wege-ANOVA (Sidaks Mehrfachvergleichstest) verwendet (n = 6 unabhängige Stichproben). (d) Relative Masse von Rinderserumalbumin (BSA), geladen für drei verschiedene große Chargen von MNPs, normalisiert auf den Durchschnitt. Der Bartlett-Test (p = 0,006) ergab, dass die Standardabweichungen erheblich unterschiedlich sein könnten, und zweiseitige t-Tests zwischen den Gruppen ergaben, dass bei 30 mm aufgetragene Pflaster eine deutlich andere Standardabweichung als die anderen beiden Gruppen aufwiesen, die vergleichbar waren einander (n = 50 Patches für handgefertigte; n = 40 Patches für jede der untersuchten Abgabehöhen). (e) Ladeeffizienz pro Pflaster für 10 μg eines DNA-Impfstoffs für n = 100 MNPs, die mit dem MVP hergestellt wurden. Die Daten stellen Mittelwerte ± Standardabweichung dar. P-Werte werden dargestellt durch: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. NS, nicht signifikant.

(a) mRNA-verkapselte Konzentration, (b) mRNA-Verkapselungseffizienz und (c) Durchmesser von LNPs, die mit zwei verschiedenen ionisierbaren Lipiden (cKK-e12 oder Lipid 5) hergestellt wurden und mRNA einkapseln, die für fLuc oder RBD kodiert (n = 3). (d) Lebensfähigkeit von HeLa-Zellen gemessen in Gegenwart von 0,6 mg der Formulierung und 50 ng mRNA, eingekapselt in mit cKK-e12 hergestellten LNPs (n = 4 technische Replikate). (e) Gesamttrocknungszeit für MNPs, die aus verschiedenen Polymerformulierungen unter Verwendung von Polyvinylalkohol (PVA) oder Polyvinylpyrrolidon (PVP10 oder PVP60, 10 kDa bzw. 60 kDa Molekulargewicht) hergestellt wurden. Es wurden zwei unterschiedliche Trocknungsansätze untersucht: 10-stündiges Trocknen unter Stickstoffstrom vor dem Vakuum oder 24-stündiges Trocknen mit Trockenmittel vor dem Vakuum (n = 1). 100 % PVP-Pflaster waren zu spröde, um sie ohne Bruch aus der Form zu entfernen. (f) Steifheit und (g) Spitzenkraft, gemessen im Kompressionstest von mRNA-LNP-beladenen MNPs aus verschiedenen Polymeren. Es wurde eine gewöhnliche einfaktorielle ANOVA (Sidaks Mehrfachvergleichstest) verwendet (n = 5 pro Gruppe). (h) mrna-lnp-Durchmesser, gemessen durch dynamische Lichtstreuung (dls) unmittelbar nach der Synthese, nach der Konzentration, nach der Formulierung in Impfstofftinte und nach dem Trocknen zur Bildung einer MNP-Matrix. (n = 3 pro Gruppe). Repräsentative Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Kryo-TEM-Bilder für (i) mRNA-LNPs nach der Synthese, (j) mRNA-LNPs in Impfstofftinte und (k) mRNA-LNPs in Mikronadelpflastern. (l) mRNA-Fragmentanalyse von FLuc-mRNA-LNPs, mRNA aus Impfstofftinte und mRNA von MNPs, charakterisiert mittels Kapillarelektrophorese. (m) Verkapselte mRNA-Verteilung in den Nadeln eines Mikronadelpflasters. (n) Histogramm der eingekapselten mRNA-Beladung pro Nadel. (o) Verkapselte mRNA-Beladung und (p) Beladungseffizienz pro Patch (n = 2 unabhängige Proben). (q) Proteinexpression nach HeLa-Transfektion mit LNPs (6 technische Replikate) oder denselben LNPs, die aus dem Mikronadelpflaster wieder aufgelöst wurden (n = 2 unabhängige Proben, 6 technische Replikate pro MNP). Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar

(a) Abmessungen einer einzelnen Mikronadel, die in Pyramiden- oder konischen Mikronadelpflastern verwendet wird. Der Abstand zwischen zwei benachbarten Nadeln (Pitch) beträgt 1000 µm. (b) Repräsentative optische Abbildung der Nadelauflösung bei Anwendung ex vivo auf Schweinehaut als Funktion der Zeit für MNPs mit Pyramiden- und Kegelform. (c–e) Vergleich zwischen konischen und pyramidenförmigen Mikronadeln aus PVP:PVA 2:1 und 1:1, hinsichtlich des gelösten Volumens in Ex-vivo-Schweinehaut. Ungepaarte, zweiseitige T-Tests (n = 23–59 Nadeln pro Gruppe). Die Daten stellen Mittelwerte ± Standardabweichung dar. P-Werte werden dargestellt durch: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. NS, nicht signifikant.

(a) Schematische Darstellung der SARS-CoV-2-RBD-Sequenz der in diesem Artikel verwendeten mRNA-Konstrukte. Die Signalsequenz (SS) ist orange gefärbt, die RBD-Domäne ist blau gefärbt und das T4-Trimerisierungsmotiv ist grün gefärbt. (bc) LNPs, die mRNA einkapseln, die für fLuc kodiert, wurden mit verschiedenen wasserlöslichen Polymeren gemischt und getrocknet. LNPs wurden vor ihrer Vermischung mit der Polymermatrix entweder in PBS oder DI-Wasser dialysiert. Die Proteinexpression in HeLa-Zellen wurde nach der Transfektion mit wieder aufgelöstem Polymer gemessen, um nach einer Kombination von Polymeren zu suchen, die eine mit LNPs in Suspension vergleichbare Proteinexpression erzeugt (n = 4 technische Replikate). (dE) Die Tröpfchengröße ist entscheidend für eine hohe Impfstoffbeladungseffizienz. Aufgrund des Marangoni-Effekts hat eine größere Tröpfchengröße (d) eine geringere Beladungseffizienz als ein kleines Tröpfchen (e), das in der Mitte einer Form verteilt wird. (f) HEK-Zellen, transfiziert mit LNP-Suspension, hergestellt mit Lipid 5 und einkapselnder mRNA, die für RBD kodiert. LNPs, die für RBD kodierende mRNA einkapseln, wurden aus einem MNP gelöst und hinzugefügt, um die Bioaktivität nach dem Laden in MNPs zu demonstrieren. RBD wird in Grün angezeigt (Alexa Fluor 488 wird als Sekundärantikörper verwendet), Aktin wird in Rot angezeigt (Rhodamin-Phalloidin) und Zellkern in Blau (DAPI). (g) MNP-Spitzenbeladung (h) und Beladungseffizienz verschiedener mRNA-LNP-Konstrukte, die für In-vivo-Studien verwendet werden (n = 3 unabhängige Proben). Für In-vivo-Studien wurden vier MNPs mit 1,5 μg pro Pflaster verabreicht, um eine theoretische Dosis von 6 μg zu ergeben. (i) Von den 6 μg mRNA, die für die MNP-Herstellung verwendet wurden, haben wir den Prozentsatz der in verschiedenen Regionen des MNP gewonnenen mRNA ermittelt. Ungefähr 25 % wurden in den Mikronadeln gefunden, was mit der Beladungseffizienzmessung übereinstimmt, und die restliche mRNA wurde im Träger gefunden. Die angegebene Gesamtsumme ist die Summe aus Nadeln und Trägermaterial, was zeigt, dass die gesamte mRNA im MNP enthalten war (n = 5 unabhängige Proben). Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar

(a) Immunisierungsschema für ein In-vivo-Experiment an C57BL/6-Mäusen. (b) Kinetik der FLuc-mRNA-Expression, gemessen durch Lumineszenz. 1 μg mRNA in mRNA-LNPs wurde C57BL/6-Mäusen entweder durch intramuskuläre (IM) Injektion oder Mikronadelpflaster (MNP)-Anwendung verabreicht (n = 5 biologisch unabhängige Proben). Die mRNA-Expression erreicht bei MNPs ihren Höhepunkt später als bei der Suspension von mRNA-LNPs. (c) FLuc-Expression nach 1-monatiger Lagerung bei 37 °C in PVP:PVA 1:1 MNP-mRNA-LNPs. Es wurde eine gewöhnliche Zwei-Wege-ANOVA (Sidaks Mehrfachvergleichstest) verwendet (n = 5 biologisch unabhängige Proben). (d) Immunogenität von Mikronadelpflastern, die entweder 1 Monat (1 Monat) oder 3 Monate (3 Monate) gelagert wurden, unter Verwendung eines Elektrochemilumineszenztests, der die Stärke der Bindungsreaktionen der SARS-CoV-2-S-Protein-Rezeptor-Bindungsdomäne misst. Alle BALB/c-Mäuse wurden mittels intramuskulärer Injektion (IM) mit einer 10-μg-Dosis SARS-CoV-2-RBD-mRNA geprimt. In Woche 4 wurde eine Auffrischungsdosis angewendet, die je nach Lagerzeit und Zustand variierte, mit Ausnahme einer Gruppe, die zum Vergleich keine Auffrischungsimpfung erhielt. Das Serum wurde 3 Wochen (vor der Auffrischung) und 9 Wochen (nach der Auffrischung) gesammelt (n = 5 biologisch unabhängige Proben). Die Daten stellen den Mittelwert ± SD NS dar, nicht signifikant.

Ergänzende Anmerkungen 1–4 und ergänzende Tabelle 1.

Film S1.

Film S2.

Film S3.

Film S4.

Film S5.

Springer Nature oder sein Lizenzgeber (z. B. eine Gesellschaft oder ein anderer Partner) besitzen die ausschließlichen Rechte an diesem Artikel im Rahmen einer Veröffentlichungsvereinbarung mit dem Autor bzw. den Autoren oder anderen Rechteinhabern. Die Selbstarchivierung der akzeptierten Manuskriptversion dieses Artikels durch den Autor unterliegt ausschließlich den Bedingungen dieser Veröffentlichungsvereinbarung und geltendem Recht.

Nachdrucke und Genehmigungen

vander Straeten, A., Sarmadi, M., Daristoteles, JL et al. Ein Mikronadel-Impfstoffdrucker für thermostabile COVID-19-mRNA-Impfstoffe. Nat Biotechnol (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-023-01774-z

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Eingegangen: 10. Januar 2022

Angenommen: 30. März 2023

Veröffentlicht: 24. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-023-01774-z

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