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Jul 01, 2023

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Nature (2023)Diesen Artikel zitieren 449 Zugriffe 304 Details zu altmetrischen Metriken Antibiotika-Bindungsstellen befinden sich in wichtigen Domänen essentieller Enzyme und wurden in den USA eingehend untersucht

Natur (2023)Diesen Artikel zitieren

449 Zugriffe

304 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Antibiotika-Bindungsstellen befinden sich in wichtigen Domänen essentieller Enzyme und wurden im Zusammenhang mit Resistenzmutationen ausführlich untersucht; Ihre Studie ist jedoch durch die positive Selektion begrenzt. Mithilfe von Multiplex-Genom-Engineering1 zur Überwindung dieser Einschränkung generieren und charakterisieren wir eine Sammlung von 760 Einzelrestmutanten, die die gesamte Rifampicin-Bindungsstelle der Escherichia coli-RNA-Polymerase (RNAP) umfassen. Durch die genetische Kartierung von Arzneimittel-Enzym-Wechselwirkungen identifizieren wir eine Alpha-Helix, in der Mutationen die Rifampicin-Bindung erheblich verstärken oder unterbrechen. Wir finden Mutationen in dieser Region, die die Bindung von Antibiotika verlängern und Rifampicin von einem bakteriostatischen in einen bakteriziden Wirkstoff umwandeln, indem sie tödliche DNA-Brüche induzieren. Letztere sind replikationsabhängig, was darauf hindeutet, dass Rifampicin abtötet, indem es schädliche Transkriptions-Replikationskonflikte an den Promotoren verursacht. Wir identifizieren auch zusätzliche Mutationen an der Bindungsstelle, die die Geschwindigkeit von RNAP erheblich erhöhen. Schnelles RNAP entzieht der Zelle Nukleotide, verändert die Empfindlichkeit der Zelle gegenüber verschiedenen Antibiotika und bietet einen Vorteil beim Kaltwachstum. Schließlich entdecken wir durch die Kartierung der natürlichen rpoB-Sequenzvielfalt, dass funktionelle Mutationen der Rifampicin-Bindungsstelle, die die RNAP-Eigenschaften verändern oder Arzneimittelresistenz verleihen, in der Natur häufig vorkommen.

Zusätzlich zu ihrer Bedeutung bei der Bekämpfung klinischer Resistenzen2,3,4 hat die Untersuchung antibiotikaresistenter Mutanten auch unser Verständnis grundlegender biologischer Prozesse erweitert5. Da Antibiotika wirken, indem sie auf Enzyme abzielen, die für das Überleben der Bakterien notwendig sind, waren Resistenzmutationen maßgeblich an der Charakterisierung wesentlicher zellulärer Maschinen wie der RNA-Polymerase6,7,8,9,10 (RNAP) und des Ribosoms11,12,13,14 beteiligt. Es wurde gezeigt, dass Resistenzmutationen unbeabsichtigt die Funktion von Antibiotika-Zielen verändern, was neue Einblicke in die verschiedenen funktionellen6,11,15, regulatorischen16 und physiologischen Eigenschaften12,17,18 essentieller Enzyme liefert und Antibiotika-Bindungsstellen als phänotypische Hotspots identifiziert.

Die Bindungsstelle von Rifampicin (Rif), einem spezifischen Inhibitor der bakteriellen RNAP, ist durch hochauflösende Strukturen8,10,19 gut definiert, die frühere genetische Befunde resistenter Mutanten bestätigen20. Die hochaffine Bindung von Rif verhindert die Verlängerung entstehender RNA über eine Länge von drei Nukleotiden hinaus und die Rif-Bindung geht in resistenten Mutanten verloren. Insgesamt weisen Resistenzmutanten eine faszinierende Bandbreite an Phänotypen auf, die eine Folge von Veränderungen der Eigenschaften des mutierten Enzyms in jedem Schritt des Transkriptionszyklus sind15,16,21,22,23,24. Obwohl Rif für seine Hochfrequenzresistenz berüchtigt ist4,25,26, macht das bekannte Spektrum resistenter Mutanten weniger als 5 % des nichtredundanten Mutationsraums in dieser Region der β-Untereinheit von RNAP aus. Daher ist unser funktionelles Verständnis der Rif-Bindungsstelle noch unvollständig.

Das automatisierte Multiplex-Genom-Engineering (MAGE) in Verbindung mit der Sequenzierung ist frei von den Einschränkungen positiver Selektion und niedriger Mutationsraten27,28,29. Dieses System ermöglicht die Einführung und Überwachung von Mutationen in einer interessierenden Region auf dem Bakterienchromosom mit extrem hoher Effizienz und Spezifität1,30,31 und wurde zuvor zur Charakterisierung der Codonoptimierung und Sequenzdiversität über die essentiellen Gene infA und rpoD27,28 hinweg verwendet.

In dieser Arbeit generieren wir eine Sammlung von RNAP-Mutanten, die alle möglichen Substitutionen an jeder Position der Rif-Bindungsstelle umfassen. Wir stellen eine detaillierte genetische Karte der Rif-Bindungsinteraktionen bereit und identifizieren eine Alpha-Helix, die sich über rpoB 521–526 erstreckt und in der Mutationen die Rif-Potenz entweder erhöhen oder verringern können. In dieser Region entdecken wir Einzelrestmutanten, die Rif von einem bakteriostatischen in ein bakterizides Medikament umwandeln, indem sie seine Bindungsaffinität erhöhen und DNA-Schäden verursachen. Wir zeigen, dass die bakterizide Wirkung von der aktiven Replikation abhängt, was darauf hindeutet, dass RNAP, das von Rif an Promotoren eingefangen wird, schädliche Transkriptions-Replikationskonflikte verursacht. Wir beschreiben andere Einzelrestmutationen in der Rif-Bindungsstelle, die schnelles RNAP produzieren, und stellen fest, dass eine hohe Transkriptionsgeschwindigkeit der Zelle Nukleotide entzieht, was die Anfälligkeit für Antibiotika erhöht, aber auch von Vorteil sein kann, da sie durch eine schlechte Terminierung einen Wachstumsvorteil bei niedrigeren Temperaturen bietet Effizienz. Trotz hoher evolutionärer Erhaltung identifizieren wir funktionelle Mutationen der Rif-Bindungsstelle, die in der Natur häufig vorkommen. Unsere Arbeit zeigt, dass die Rif-Bindungsstelle eine multifunktionale Domäne von RNAP ist, und ihre Charakterisierung erweitert unser Verständnis des antibakteriellen Potenzials von Rif und der Beziehung zwischen Transkriptionsgeschwindigkeit und bakterieller Physiologie.

Wir haben einen gesättigten Pool einzelner Aminosäuresubstitutionen in den rpoB-Positionen 510–537 und 563–572 mithilfe von MAGE in Verbindung mit Sequenzierung27 generiert und überwacht (Abb. 1a, b). Es wurde gezeigt, dass diese Positionen entweder strukturell oder genetisch mit Rif interagieren8,10 und umfassen Resistenzmutanten, die am häufigsten in klinischen Isolaten vorkommen9. Nach einem MAGE-Zyklus haben wir Sequenzierungsbibliotheken vorbereitet, um die Effizienz der Oligo-Rekombination abzuschätzen, und die meisten der erwarteten Substitutionen mit einer Häufigkeit zwischen 10−3 und 10−5 abgerufen (Abb. 1c und erweiterte Daten Abb. 1a). Wir konnten mehr als 99 % der generierten Mutanten vor der Selektion reproduzierbar nachweisen, was in unserem experimentellen Design für die Identifizierung empfindlicher Mutanten von entscheidender Bedeutung ist (Abb. 1d).

a: Die Rif-Bindungsstelle innerhalb der rpoB-Untereinheit von E. coli RNAP (in blau), vergrößert im unteren Feld (PDB 5UAC). b, Schematische Darstellung der Mutantenpool-Generierung. MAGE-Oligos wurden entwickelt, um einen gesättigten Pool von 760 Einzelcodon-Mutanten (20 Substitutionen × 38 Positionen) innerhalb der Rif-Bindungsstelle zu erzeugen. c, Repräsentative Heatmap der Mutantenhäufigkeiten, die mit MAGE zum Zeitpunkt 0 (T0) und zum Zeitpunkt 1 (T1) nach dem Fitness-Screening generiert wurden. Zur Analyse der Screening-Daten wurde eine Normalisierung zwischen T1 und T0 durch Berechnung der log2(T1-Fitness/T0)-fachen Änderung durchgeführt. Die Zeilen entsprechen den rpoB-Positionen 510–537 und 563–572; Die Spalten entsprechen den Aminosäuren. Weiße Quadrate kennzeichnen Wildtyp-Reste. d, Schematische Darstellung des Screenings auf Arzneimittelsensitivität und -resistenz. Mutanten, die in LB nicht wachsen, werden als schwache Mutanten bezeichnet, wohingegen Mutanten, die nur in Medikamenten nicht wachsen, als medikamentensensitiv gelten. Arzneimittelspezifische Wirkungen können isoliert werden, indem die Häufigkeit von „T1-Arzneimittel“-Mutanten auf „T1-Fitness“ normalisiert wird, d. h. log2 (T1-Arzneimittel/T1-Fitness).

Quelldaten

Um arzneimittelempfindliche von nicht lebensfähigen Mutanten zu unterscheiden, haben wir zunächst die Fitness der Mutanten unter normalen Wachstumsbedingungen überwacht. Wir bereiteten Proben aus Zellen in Flüssigkultur nach zwei aufeinanderfolgenden 100-fachen Verdünnungen vor, sodass die Zellen vor der Sammlung die gleiche optische Dichte (OD) erreichen konnten (Erweiterte Daten, Abb. 1a). Wir haben auch Proben vorbereitet, nachdem wir den Mutantenpool auf Agarplatten passagiert hatten (Extended Data Abb. 1a und 2c, d). Wie erwartet werden Stoppcodons schnell erschöpft (Abb. 1c und erweiterte Daten Abb. 1a – d). Wir haben auch beobachtet, dass die Verteilung der Fitnesseffekte in dieser Region von rpoB bimodal ist, wobei ein Peak neutrale Substitutionen bei 0 und der andere schädliche Substitutionen bei –2 darstellt (Extended Data, Abb. 2b). Andere systematische Mutagenesestudien an essentiellen Proteinen haben die gleiche bimodale Verteilung beobachtet27,28. Wenn 0 als Schwellenwert für nicht lebensfähige Mutanten verwendet wird, sind 58 % der Substitutionen nicht lebensfähig, was mit Werten von 53 % bzw. 48 % für rpoD bzw. infA vergleichbar ist27,28.

Als nächstes haben wir unsere Sammlung von rpoB-Mutanten mit Rif, Bicyclomycin (BCM) und 5-Fluorouracil (5FU) gescreent und die Daten normalisiert, um arzneimittelspezifische Wirkungen zu isolieren (Abb. 1d und erweiterte Daten Abb. 1–3). Wir haben BCM, einen Inhibitor der Rho-Termination, und 5FU, ein Nukleotidanalogon, ausgewählt, da zuvor gezeigt wurde, dass Rif-resistente Mutanten einen Mangel an Rho-Terminierung32 und eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Nukleotidanaloga4 aufweisen. Interessanterweise ist dieser relativ kleine RNAP-Bereich reich an Mutationen, die eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber diesen Verbindungen bieten (Abb. 2a und erweiterte Daten Abb. 1). Rif-Widerstand tritt an bekannten Positionen auf; Allerdings ist die Bandbreite der Resistenz verleihenden Substitutionen viel größer (Abb. 2a und 3a). Wir stellen fest, dass einige Mutationen, wie beispielsweise die an Position 531, relativ strukturlos sind, obwohl bekannt ist, dass sie eine Rif-Resistenz verursachen10. Dies liegt daran, dass diese Mutanten im Allgemeinen langsam wachsen, wie das Fitness-Screening zeigt, und daher schwer zu erkennen sind, da sie im Screening-Format sehr resistent sind (Extended Data Abb. 1a und 2a; Methoden). Resistenz gegen BCM wird bei Mutationen in der Region um Position 567 beobachtet (Abb. 2a, b und erweiterte Daten Abb. 3a, b, e, f). In dieser Region scheint auch eine 5FU-Resistenz aufzutreten (Abb. 2a, b und erweiterte Daten Abb. 3c, d, g, h).

a, Aggregierte Heatmap der Fitness und Empfindlichkeit der rpoB-Mutanten gegenüber Rif, BCM und 5FU. Die Spalten entsprechen den einzelnen Screening-Modalitäten und die Zeilen stellen die einzelnen Aminosäurepositionen dar. b, Proteinstruktur der Rif-Bindungsstelle mit einer Farbkarte der durchschnittlichen Positionsfitness oder Empfindlichkeit gegenüber Rif, BCM oder 5FU. Resistenz- oder High-Fitness-Mutationen werden rot dargestellt. Z-Scores werden für jede Screening-Modalität aus MAGE-seq-Experimenten berechnet, die in n = 3 biologisch unabhängigen Replikaten durchgeführt wurden.

Quelldaten

a, Empfindlichkeits- und Resistenzlandschaft von rpoB-Mutanten gegenüber Rif. Die Zeilen entsprechen der rpoB-Position und die Spalten bezeichnen alle 20 Aminosäuresubstitutionen, gruppiert nach Eigenschaft. Weiße Quadrate kennzeichnen Wildtyp-Reste. Rechts neben der Heatmap wird ein Balkendiagramm der durchschnittlichen Positionsfaltenänderung angezeigt. b, Vulkandiagramm der Daten in a. Stoppcodons sind grau. c, MHK von Rif in überempfindlichen Mutanten (P = 1,2 × 10−4, 2,1 × 10−3 von links nach rechts). d, Metaanalyse des ChIP-seq-Signals von Wildtyp (WT) und rpoB T525D-RNAP um Transkriptionsstartstellen (TSS) hochtranskribierter Gene nach 1-stündiger Erholung nach 1-stündiger Behandlung mit 80 µg ml-1 Rif. e, Plattierungseffizienz überempfindlicher Mutanten nach 1-stündiger Behandlung mit 80 µg ml−1 Rif (n = 6; P = 5,7 × 10−4, 1,8 × 10−4). f, DNA-Schaden gemessen durch TUNEL-Färbung in überempfindlichen Mutanten nach einstündiger Behandlung mit 80 µg ml−1 Rif. TUNEL-positive Zellen sind der Prozentsatz der Zellen, die das Signal überschreiten und in mehr als 99 % der unbehandelten Zellen nachgewiesen wurden (n = 4; P = 1,3 × 10–2, 4,7 × 10–3). g, Plattierungseffizienz von hypersensitiven Mutanten in recA- oder recBCD-Knockout-Stämmen nach 1-stündiger Behandlung mit 80 µg ml−1 Rif (n = 4, P = 5,3 × 10−2, 7,3 × 10−3, 4,2 × 10−5, 5,7 × 10−5). h, Anzahl der DSBs pro 10 Kilobasen (kb) an Promotoren und über dem Genkörper, gemessen mit SLR-qPCR nach 1-stündiger Behandlung mit 80 µg ml−1 Rif (P = 2,4 × 10−3, 1,7 × 10−5, 1,2). × 10−4, 3,7 × 10−3, 2,4 × 10−5, 4,2 × 10−5). i, Plattierungseffizienz von überempfindlichen Mutanten im PC2-Hintergrund, die ein temperaturempfindliches Allel des Replikationsproteins dnaC enthalten (P = 1,8 × 10−3, 7,6 × 10−5). Die Replikation wurde blockiert, indem die Zellen 1,5 Stunden lang auf 42 °C gebracht wurden, bevor sie 30 Minuten lang mit 80 µg ml-1 Rif behandelt wurden. Balkendiagramme stellen den Mittelwert von n = 3 biologisch unabhängigen Experimenten dar, sofern nicht anders angegeben, wobei Fehlerbalken 95 %-Konfidenzintervalle angeben. P-Werte werden mithilfe des unabhängigen t-Tests (zweiseitig) berechnet.

Quelldaten

Durch die Berechnung der durchschnittlichen Fitness aller Substitutionen an einer bestimmten Position (Abb. 2b) liefern wir ein Maß für die Mutabilität des Wildtyp-Restes. Wie für eine hochkonservierte Region eines essentiellen Proteins erwartet, sind die meisten Positionen äußerst unveränderlich, wobei Substitutionen an R529, G566 und G570 die größten durchschnittlichen Fitnessdefekte verursachen (Abb. 2b und erweiterte Daten, Abb. 2). Andererseits scheint die Alpha-Helix an den Positionen 523–527 sehr veränderlich zu sein (Abb. 2b und erweiterte Daten Abb. 2). Eine erhöhte durchschnittliche Positionsfitness weist darauf hin, dass der ursprüngliche Wildtyp-Rest in irgendeiner Weise unter unseren Wachstumsbedingungen nachteilig ist.

In ähnlicher Weise misst der durchschnittliche Positionswiderstand gegenüber jedem Arzneimittel die Bedeutung des Wildtyp-Restes für die Arzneimittelaktivität. Mehrere Mutationen in den Positionen 516, 526 und 572 erhöhen die durchschnittliche Resistenz gegenüber Rif (Abb. 2b und 3a), was darauf hinweist, dass der Wildtyp-Rest in diesen Positionen für die Rif-Bindung wichtig ist. Ein hoher Widerstand an einigen Positionen wird durch eine einzelne bestimmte Substitution wie R529K oder P564K (Abb. 3a) verursacht, was bedeutet, dass der substituierte Rest die Rif-Bindung beeinträchtigt. Mutationen an Position 567 erhöhen die durchschnittliche Resistenz gegenüber BCM und 5FU (Abb. 2b und Extended Data Abb. 3), was darauf hindeutet, dass das ursprüngliche Prolin die Empfindlichkeit gegenüber diesen Arzneimitteln erhöht. Umgekehrt misst die durchschnittliche Positionssensitivität die Beeinträchtigung der Arzneimittelaktivität durch den Wildtyp-Rest. Beispielsweise scheint das Wildtyp-Threonin an Position 525 die Rif-Bindung zu beeinträchtigen, da viele Mutationen an dieser Position die Empfindlichkeit erhöhen (Abb. 2b und 3a). Die Positionsempfindlichkeit oder -resistenz liefert einen Hinweis auf die funktionelle und strukturelle Bedeutung jeder Position bei der Auflösung einzelner Aminosäuren.

Bei der Untersuchung des Verhaltens einzelner Mutationen als Reaktion auf Rif waren wir neugierig, Rif-überempfindliche (RifHS) Mutanten in den Positionen 514, 521 und 525 (Abb. 3a) mit den Substitutionen L521Y (21Y) und T525D (25D; durchgehend Mutanten) zu finden aus unserer Sammlung werden mit den letzten beiden Ziffern der Position und der substituierten Aminosäure abgekürzt, wodurch der stärkste Phänotyp entsteht (Abb. 3b). Diese Substitutionen weisen keinen Fitnessmangel auf, was darauf hinweist, dass ihre Verdünnung beim Züchten mit Rif kein Artefakt der Mutantenschwäche ist (Abb. 3b und erweiterte Daten Abb. 4a). Sie befinden sich auch auf einer Alpha-Helix in unmittelbarer Nähe von Mutationen, die eine hohe Resistenz verleihen (Abb. 2b und 3a).

Die RifHS-Mutanten 21Y und 25D wurden zur weiteren Charakterisierung in einem Wildtyp-MG1655-Hintergrund rekonstruiert. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen des primären Screenings nahmen Wildtyp-Zellen 2 Stunden nach hoher Rif-Exposition ihr Wachstum wieder auf, wohingegen RifHS-Mutanten mehr als 8 Stunden brauchten, um sich zu erholen (Extended Data Abb. 4b). Diese Mutationen führen auch zu einer verringerten minimalen Hemmkonzentration (MHK) für Rif (Abb. 3c und erweiterte Daten Abb. 4c).

Um die Interaktion von Rif mit RifHS-RNAP direkt zu testen, haben wir die Mutante 21Y zur rekombinanten Expression und Reinigung geklont. In einem modifizierten Ablaufexperiment, bei dem die Polymerase mit Rif gesättigt, gewaschen und dann die Transkription wieder aufgenommen wird, erholt sich 21Y langsamer, was auf eine stärkere Rif-Bindung hinweist (Extended Data, Abb. 4d). Dies ist nicht auf Unterschiede in der katalytischen Aktivität zurückzuführen, da die Geschwindigkeit der 3-mer-Synthese unverändert bleibt, wobei 3-mer die maximale Produktlänge einer durch Rif8 blockierten Polymerase darstellt. Um zu testen, ob Rif dazu führt, dass RifHS-RNAP in vivo an Promotoren verbleibt, führten wir eine Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierung (ChIP-seq) an RNAP durch, nachdem wir die Zellen eine Stunde lang mit Rif behandelt, gewaschen und den Zellen eine weitere Stunde lang erlaubt hatten, sich zu erholen. Nach der Erholung bleibt im Vergleich zu Wildtyp-Zellen mehr RifHS-RNAP an den Promotoren bestehen (Abb. 3d und erweiterte Daten, Abb. 4e).

Es ist bekannt, dass Rif bei Escherichia coli bakteriostatisch wirkt. Um RifHS-Mutanten auf Zelltötung zu testen, wurden die Zellen mit Rif behandelt, gewaschen und Reihenverdünnungen entweder auf Agarplatten oder in flüssiger Brühe (LB)18 auf Wachstum untersucht. Obwohl Rif in Wildtyp-Zellen bakteriostatisch bleibt, wird es für beide RifHS-Mutanten in E. coli bakterizid und verringert die Lebensfähigkeit um mindestens eine Größenordnung (Abb. 3e und erweiterte Daten Abb. 5a – d). Dieser Effekt ist spezifisch für Rif, da Chloramphenicol und Tetracyclin bakteriostatisch bleiben (Extended Data Abb. 5e).

Frühere Studien berichten von einer erhöhten Empfindlichkeit von Mutanten zur Reparatur von DNA-Schäden als Reaktion auf die Rif-Behandlung33. Um die bakterizide Wirkung von Rif zu untersuchen, verwendeten wir die Nick-End-Markierung der terminalen Desoxynukleotidyltransferase Desoxyuridintriphosphat (dUTP) (TUNEL)34, um die DNA-Fragmentierung nach 1 Stunde Rif-Behandlung zu beurteilen. Wildtyp-Zellen weisen nach der Rif-Behandlung eine schwache TUNEL-Färbung von etwa 15 % der positiven Zellen auf, was niedriger ist als bei jedem in früheren Arbeiten getesteten bakteriziden Antibiotikum35 (Abb. 3f). Beide RifHS-Mutanten zeigen bei Rif-Behandlung einen Anstieg der TUNEL-Färbung um bis zu 35 %, ähnlich wie bei anderen bakteriziden Arzneimitteln wie 5FU und Norfloxacin (ca. 30 %)35.

Um festzustellen, ob DNA-Brüche zur bakteriziden Wirkung von Rif beitragen, haben wir in RifHS-Mutanten Knockouts der Reparaturenzyme recA oder recBCD für große Doppelstrangbrüche (DSB) erzeugt. Bemerkenswert ist, dass Rif in beiden RifHS-Mutanten ohne DSB-Reparatur stark bakterizid wirkt (Abb. 3g). Darüber hinaus reagieren Wildtyp-Zellen, denen recA fehlt, empfindlich auf die Abtötung durch Rif (Abb. 3g), was einen weiteren Beweis dafür liefert, dass Rif in Wildtyp-Zellen geringe DNA-Schäden verursacht (Abb. 3f). Wir stellen fest, dass diese Effekte Rif-spezifisch sind, da RifHS-Mutanten, denen die DSB-Reparatur fehlt, gegenüber anderen bakteriostatischen Arzneimitteln unempfindlich bleiben (Extended Data Abb. 5f).

Als sekundären Indikator für DNA-Schäden haben wir die Expression von Schlüsselgenen in der SOS-Reaktion gemessen. Bei der Rif-Behandlung sehen wir einen signifikanten Anstieg der Expression von Genen, die an der DSB-Reparatur beteiligt sind (Extended Data Abb. 6a). Wir haben auch die Proteinspiegel des SOS-Genrepressors LexA nach der Rif-Behandlung gemessen und beobachtet, dass die LexA-Proteinspiegel nach der Rif-Behandlung signifikant abnehmen, was darauf hindeutet, dass es als Reaktion auf DNA-Schäden gespalten wird (Extended Data Abb. 6b, c). In Übereinstimmung mit früheren Arbeiten führt die bakterizide Wirkung von Rif nicht zu einer erhöhten Zellatmung und der Akkumulation toxischer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)36,37 (Extended Data Abb. 6d–f).

Um den Ort von DNA-Schäden in RifHS-Mutanten zu untersuchen, verwendeten wir quantitative Semi-Long-Range-PCR (SLR-qPCR), um DNA-Brüche an bestimmten Genomorten nachzuweisen (Extended Data Abb. 7a)38. Wir wählten willkürlich zwei stark exprimierte σ70-abhängige Gene an entfernten chromosomalen Orten aus und verglichen die Häufigkeit von DSBs an verwandten Promotoren mit Genkörpern (Extended Data, Abb. 7b). Bemerkenswerterweise beobachteten wir nach Rif-Behandlung sowohl bei Wildtyp- als auch bei RifHS-Mutanten einen signifikanten Anstieg der DSBs an Promotoren, wohingegen im jeweiligen Genkörper kein Anstieg auftrat (Abb. 3h). Darüber hinaus zeigten RifHS-Mutanten einen höheren Anteil an promotorspezifischen DSBs als Wildtyp-Mutanten (Abb. 3h).

Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass der Transkriptionsinitiationskomplex mit dem Replisom kollidieren oder es unterbrechen kann, was zu Störungen des Fortschreitens der Replikationsgabel oder zu schädlichen Mutationen führt39,40. Um festzustellen, ob Replikationskonflikte an Promotoren an der DNA-Schädigung durch Rif beteiligt sind, haben wir dCas9 eingeführt, das auf den oriC bei RifHS-Stämmen abzielt, um die Replikation vor der Rif-Behandlung teilweise zu blockieren (Extended Data, Abb. 7c). Wir fanden heraus, dass das Blockieren der Replikation die Häufigkeit von DSBs an Promotoren signifikant verringert (Extended Data Abb. 7d, e). Als nächstes konstruierten wir RifHS-Mutanten in Zellen, die ein temperaturempfindliches Allel des Replikationsproteins dnaC2 (PC2)39,42 enthielten. Wir haben bestätigt, dass die Verlagerung der Zellen auf die nicht zulässige Temperatur von 42 ° C die Replikation hemmt (Extended Data, Abb. 7f). Anschließend verglichen wir die bakterizide Wirkung von Rif mit und ohne Replikation. Insbesondere beobachten wir, dass Rif in RifHS-Mutanten nicht mehr bakterizid wirkt, wenn die Replikation gehemmt wird (Abb. 3i). RifHS-Mutanten im PC2-Hintergrund bleiben bei der zulässigen Temperatur von 30 °C überempfindlich (Extended Data Abb. 7g).

Zusammenfassend zeigen wir, dass: (1) RifHS-RNAP mit Rif dauerhafter an Promotoren gebunden sind; (2) die bakterizide Wirkung von Rif in RifHS-Mutanten ist mit doppelsträngigen DNA-Brüchen an Promotoren verbunden; (3) Rif induziert die SOS-Reaktion; und (4) die Rif-Abtötung ist in Zellen ohne DSB-Reparatur viel schwerwiegender. Interessanterweise geht die Abtötung von Rif nicht mit einer Ansammlung von ROS einher, was darauf hindeutet, dass es anders wirkt als andere bakterizide Antibiotika. Stattdessen beobachten wir, dass bakterizide Wirkungen und DNA-Schäden durch Rif replikationsabhängig sind, was impliziert, dass diese Wirkungen auf Transkriptions-Replikationskonflikte bei Promotoren zurückzuführen sind.

Das Potenzial von Mutationen in der Rif-Bindungstasche, die Rif-Bindung zu beeinflussen, ist offensichtlich, aber der Mechanismus, durch den sie Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber anderen Arzneimitteln verursachen, ist nicht ohne weiteres erkennbar. Durch paarweisen Vergleich der phänotypischen Screens stellten wir Korrelationen zwischen Fitness, BCM und 5FU-Empfindlichkeit fest, wohingegen bei Rif keine derartigen Korrelationen bestehen (Abb. 4a). Mutanten mit hoher Fitness reagieren äußerst empfindlich auf 5FU, insbesondere auf Substitutionen, die die α-Helix an den Positionen 523–527 stören (Abb. 2a). Darüber hinaus korreliert die Empfindlichkeit der rpoB-Mutanten gegenüber BCM und 5FU positiv, was auf einen gemeinsamen zugrunde liegenden Mechanismus hindeutet (Abb. 4a). Wir haben Mutanten mit starken Phänotypen aus jeder Screening-Modalität zur Rekonstruktion und weiteren Charakterisierung in MG1655 ausgewählt (Extended Data Abb. 1–3). Wir fanden heraus, dass die MHK aller rekonstruierten rpoB-Mutanten die Screening-Ergebnisse genau widerspiegelt. Die Mutanten 15G, 15Y, 23P, 23W, 26V und 27W sind hochempfindlich gegenüber 5FU, mit einer etwa fünffachen Abnahme der MHK (Abb. 4b); Diese Mutanten reagieren auch empfindlich auf BCM (Abb. 4c). Die Mutanten 12K, 67C, 67V und 72L weisen alle eine hohe Resistenz gegenüber BCM und 5FU auf (Abb. 4b, c).

a, Streudiagramme der rpoB-Mutantenreaktion auf 5FU im Vergleich zur Fitness oder Mutantenreaktion auf Rif und BCM. Lineare Regressionslinien, 95 %-Konfidenzintervalle und Pearson-R-Werte werden überlagert. Zweiseitige P-Werte für 5FU-Korrelationen mit Fitness-, Rif- und BCM-Datensätzen betragen 2,4 × 10−43, 0,11 bzw. 5,2 × 10−32. b,c, MHK von 5FU (b) und BCM (c) für empfindliche oder resistente Stämme, rekonstruiert in MG1655 (n = 2). d, Transkriptionsverlängerungsgeschwindigkeit von Wildtyp und Mutanten. Die Transkription von fünf Regionen auf dem lacZ-Gen wird nach der Induktion gemessen und als Funktion von Zeit und Distanz aufgetragen. Die Steigung der am besten angepassten Linie stellt die Geschwindigkeit der Transkriptionsverlängerung dar. e, Mittlere Pausenhäufigkeit in Wildtyp- und 5FU-empfindlichen Mutanten, gemessen mit NETseq. Die Werte geben die aggregierte mittlere Pausenhäufigkeit pro Kilobase für die 3.500 am häufigsten exprimierten Gene an. n = 2 biologisch unabhängige Experimente für jede Bedingung (P = 1,6 × 10−3, 9,8 × 10−25, 7,2 × 10−22 von links nach rechts). f, Pyrimidine in 5FU-empfindlichen Mutanten, nachgewiesen durch LC-MS, normalisiert auf markiertes UTP (n = 5; P = 2,4 × 10–6, 5,6 × 10–4, 8,9 × 10–5, 6,4 × 10–5, 5,0 × 10−2, 8,4 × 10−3). g, Plattierungseffizienz von 5FU-empfindlichen Mutanten mit und ohne Thymidin-Supplementierung. Zellen aus Übernachtkulturen wurden seriell verdünnt und auf LB-Agarplatten mit den angegebenen Konzentrationen von 5FU in µg ml−1 mit und ohne 1 mg ml−1 Thymidin (P = 3,1 × 10−3, 8,6 × 10−3, 4,7 ×) ausplattiert 10−3). h, Beschichtungseffizienz von 5FU-empfindlichen Mutanten mit den angegebenen Trimethoprim-Konzentrationen (P = 2,5 × 10–4, 7,6 × 10–4, 3,3 × 10–3). Balkendiagramme stellen den Mittelwert von n = 3 biologisch unabhängigen Experimenten dar, sofern nicht anders angegeben, wobei Fehlerbalken 95 %-Konfidenzintervalle angeben. P-Werte werden mithilfe des unabhängigen t-Tests (zweiseitig) berechnet.

Quelldaten

BCM wirkt durch Hemmung des Rho-Transkriptionsterminationsfaktors. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Polymerasegeschwindigkeit die Effizienz der Rho-Terminierung bestimmt32. Um zu testen, ob Mutanten, die sowohl auf 5FU als auch auf BCM reagieren, eine schnellere RNAP aufweisen, haben wir ihre Elongationsrate mithilfe eines Multisonden-qPCR-Assays entlang des Lac-Operons und ihre Pausenfrequenz mithilfe nativer Elongating-Transkript-Sequenzierung (NETseq) gemessen4,43. Tatsächlich haben diese Mutanten eine höhere Verlängerungsrate (Abb. 4d) und pausieren seltener (Abb. 4e) als Wildtyp-RNAP.

Wir haben die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass hohe Transkriptionsraten in schnellen RNAP-Mutanten die Nukleotidpools erschöpfen, was zu einer 5FU-Empfindlichkeit führt. Ein bekanntes Ziel von 5FU ist thyA, das für das Enzym kodiert, das für die dTMP-Synthese verantwortlich ist. dUMP, das Substrat für diese enzymatische Reaktion, wird aus Pyrimidin-Ribonukleotiden hergestellt. Daher würde ein Stamm im Pool von Pyrimidin-Ribonukleotiden die Zellen für 5FU44,45 sensibilisieren. Mithilfe der Hybrid-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) stellten wir fest, dass 5FU-empfindliche Mutanten an den beiden nachweisbaren Pyrimidinen Uridin und Cytidintriphosphat auf das Niveau einer Upp-Mutante mit einem Mangel an Uracil-Salvage erschöpft sind (Abb. 4f). 15Y, ein Mutant, der unglaublich empfindlich auf 5FU reagiert, weist ebenfalls keine Purine auf (Extended Data Abb. 9d). Tatsächlich rettete die Thymidin-Supplementierung die 5FU-Empfindlichkeit der Mutanten 15Y, 26V und 27W (Abb. 4g) sowie den Wachstumsdefekt von 15Y unter normalen Wachstumsbedingungen bei 37 °C (Extended Data Abb. 9e). Bemerkenswert ist, dass geringfügige Änderungen im Expressionsniveau von Genen für die Nukleotidbiosynthese nicht für die 5FU-Empfindlichkeit schneller Mutanten verantwortlich sind (Extended Data Abb. 8 und 9a – c).

Da 5FU das Bakterienwachstum durch einen komplexen Mechanismus hemmt, der nicht nur den Abbau von dTMP, sondern auch den Fehleinbau in DNA und RNA umfasst, haben wir versucht, mithilfe von Thymidin-spezifischen Tests die Empfindlichkeit gegenüber dem Abbau von dTMP festzustellen. Zuerst haben wir getestet, ob schnelle Mutanten anfälliger für den „Thymin-losen Tod“ sind, indem wir schnelle Mutanten vor dem genetischen Hintergrund von thyA konstruiert haben, das für das Wachstum eine Thymidin-Supplementierung erfordert. Wenn Thymidin entfernt wird, können Zellen während einer „Resistenzphase“ von den vorhandenen dTMP-Reservoirs leben, bevor ihre Lebensfähigkeit verloren geht46. Um einen schnelleren Abbau von intrazellulärem Thymidin zu belegen, weisen schnelle Mutanten in einem thyA-Hintergrund eine kürzere Resistenzphase auf als Wildtyp-RNAP (Extended Data, Abb. 9f). Bemerkenswert ist, dass das gut untersuchte rpoB 513P, ein langsames RNAP15,47, resistenter gegen 5FU ist und im thyminlosen Todestest eine verlängerte Resistenzphase aufweist (Extended Data Abb. 9g,h). Zweitens haben wir die Empfindlichkeit schneller Mutanten gegenüber Trimethoprim getestet. Dieses klinisch wichtige Antibiotikum hemmt die Dihydrofolatreduktase, die neben bestimmten Aminosäuren für die De-novo-Synthese von Thymidin erforderlich ist48. Da das LB-Medium nur begrenzt Thymidin enthält, beeinflusst seine Verfügbarkeit die allgemeine Trimethoprim-Empfindlichkeit. In Übereinstimmung mit unserem Modell zur Nukleotidepletion reagieren schnelle RNAP-Mutanten auch empfindlicher auf Trimethoprim (Abb. 4h). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die RNAP-Geschwindigkeit die Verfügbarkeit von Nukleotiden innerhalb der Zelle bestimmt.

Alle von uns isolierten schnellen RNAP-Mutanten scheinen einen Fitnessvorteil im ursprünglichen Screening-Format zu haben (Extended Data Abb. 1a und 2), das bei niedrigeren Temperaturen durchgeführt wurde, die für MAGE-Rekombinationsstämme geeignet sind1. Bei der Rekonstruktion in MG1655 haben schnelle Mutanten bei 37 °C keinen solchen Wachstumsvorteil, wachsen aber alle schneller und sättigen bei einer höheren OD als Wildtyp-Zellen bei einer niedrigeren Temperatur von 25 °C (Extended Data Abb. 10a). 5FUR-Mutanten wachsen langsam bei 25 °C (Extended Data Abb. 10b). Bei 42 °C sind die schnellen Mutanten 15Y und 27W temperaturempfindlich und wachsen langsamer (Extended Data Abb. 10b). Frühere Arbeiten haben die Temperaturempfindlichkeit der natürlich vorkommenden Rif-resistenten Mutante 526Y gezeigt, die auch als schnelles RNAP7 bekannt ist. Da schnelle Polymerasen ineffizient terminieren, stellten wir die Hypothese auf, dass ein erhöhter Readthrough einen Wachstumsvorteil bei 25 °C bieten könnte. Tatsächlich wachsen Wildtyp-Zellen mit subinhibitorischen Mengen an BCM bei 25 °C schneller (Extended Data Abb. 10c). Anhand dieser Daten stellen wir fest, dass schnelles RNAP einen Wachstumsvorteil bei niedrigeren Temperaturen bietet, zumindest teilweise aufgrund einer schlechten Terminationseffizienz.

Zusammenfassend führte unsere Charakterisierung schneller RNAP-Mutanten der Rif-Bindungsstelle zu der Beobachtung, dass die Transkriptionsgeschwindigkeit die Verfügbarkeit von Nukleotiden innerhalb der Zelle steuert. Nukleotidpools sind limitierend und geringfügige Erhöhungen der RNAP-Geschwindigkeit sensibilisieren Zellen stark gegenüber Antibiotika, die auf die Nukleotidbiosynthese abzielen. Darüber hinaus beeinflusst schnelles RNAP auch wünschenswerte Wachstumsumgebungen für Bakterien, was die Frage aufwirft, ob solche Mutationen in der Natur vorkommen.

Unser Ziel war es, unsere Untersuchung von rpoB-Mutanten durch die Erforschung der natürlichen Sequenzvielfalt zu ergänzen. Nach der Ausrichtung von rund 4.000 Orthologen von E. coli rpoB, die aus KEGG49 gewonnen wurden, beobachteten wir eine hohe evolutionäre Konservierung an der Rif-Bindungsstelle durch Jensen-Shannon-Divergenz50 (Abb. 5a). Als nächstes gruppierten wir die Arten nach Stamm oder Klasse und bestimmten die Anzahl und Art der Substitutionen, die Orthologe von E. coli MG1655 rpoB innerhalb der Rif-Bindungsstelle trennen. Innerhalb dieses 38-Aminosäuren-Fensters enthielten die meisten zur Analyse verfügbaren Arten weniger als fünf Substitutionen, wobei leichte Substitutionen in eng verwandten Proteobakterien auftraten (Abb. 5b, c). Wie man in einer funktionell konservierten Region von RNAP erwarten würde, finden die häufigsten Substitutionen zwischen Aminosäuren derselben funktionellen Gruppe statt, mit Ausnahme von S522A, einer hydroxylischen zu aliphatischen Substitution, die bei fast 10 % der untersuchten Arten vorkommt (Abb. 5b, c und erweiterte Daten Abb. 2).

a: Evolutionäre Konservierung von rpoB durch Jensen-Shannon-Divergenz basierend auf der Ausrichtung von 4.055 Sequenzen. Höhere Werte weisen auf eine höhere Erhaltung hin. Die Positionen basieren auf MG1655 rpoB und die Rif-Bindungsstelle ist grau hervorgehoben. b,c, Gesamtzahl der Substitutionen (b) und Häufigkeit spezifischer Restsubstitutionen (c), die die untersuchten 4.055 rpoB-Orthologen von MG1655, gruppiert nach Stamm, trennen. Proteobakterien werden weiter nach Klassen unterteilt. Stämme mit weniger als 40 repräsentativen Arten werden unter „Sonstige“ zusammengefasst. Substitutionen, die bei weniger als 20 Arten vorkommen, werden der Kürze halber weggelassen. Im Boxplot bezeichnen das untere und obere Ende der Box jeweils Q1 und Q3. Die Whisker erstrecken sich über 1,5 × (Q3 – Q1) von jeder Seite des Kastens. d, Streudiagramme der Substitutionshäufigkeit in der Natur im Vergleich zur Substitutionsfitness, -empfindlichkeit und -resistenz. Substitutionen, die bei weniger als 20 Arten vorkommen, werden der Kürze halber weggelassen. Orange kennzeichnet Substitutionen mit signifikanten (P < 01) Phänotypen in jedem Screen. P-Werte werden mithilfe des unabhängigen t-Tests (zweiseitig) berechnet.

Quelldaten

Beim Vergleich der durchschnittlichen Positionsfitness mit der evolutionären Erhaltung sehen wir erwartungsgemäß eine negative Korrelation (Extended Data Abb. 10d). Im Allgemeinen sind hochkonservierte Positionen weniger veränderlich, außer in einigen Fällen. Beispielsweise ist Histidin bei 526 hochkonserviert, in unserem Fitnessscreening jedoch veränderlich. Die Mutation dieser Position ist wahrscheinlich auf andere Weise schädlich, weshalb sie in der Evolution selten vorkommt. Mutationen in dieser Position reagieren beispielsweise sehr empfindlich auf 5FU (Extended Data Abb. 10d).

Die durchschnittliche Positionsfähigkeit ist bei der Bestimmung der Auswirkungen von Einzelrestvarianten, die in der Natur vorkommen, begrenzt. Um zu spekulieren, wie sich die natürliche Varianz in der Rif-Bindungsstelle entwickeln könnte, verglichen wir die Häufigkeit der natürlichen Varianz mit der Substitutionsfitness in jeder Screening-Modalität (Abb. 5d). Unter den häufigsten natürlichen Varianten mit starken Phänotypen in unserem Screening sind 24L, 26N und 67Q die bemerkenswertesten. 24L kommt in mehr als 10 % der untersuchten Arten vor, weist Merkmale eines schnellen RNAP auf und kommt selten in Proteobakterien vor, häufiger jedoch in Actinobakterien und Firmicutes (Abb. 5c, d und erweiterte Daten Abb. 2 und 3). 26N kommt in 1 % der untersuchten Arten vor, weist Eigenschaften eines schnellen RNAP mit hoher Rif-Resistenz auf und kommt in Tenericutes vor (Abb. 5c, d und erweiterte Daten Abb. 2 und 3); Zu den bemerkenswerten Gattungen gehört Mycoplasma, die sich als Rif-resistent erwiesen haben9. 67Q bietet Resistenz sowohl gegen BCM als auch gegen 5FU und kommt in -Epsilonproteobacteria und den eng verwandten Aquificae vor; Zu den bemerkenswerten Arten gehören Helicobacter und Campylobacter (Abb. 5c, d). Es wurde gezeigt, dass einige Stämme von Epsilonproteobakterien gegen 5FU51 resistent sind. Zukünftige Arbeiten müssen durchgeführt werden, um die Auswirkungen der identifizierten Mutationen in diesen Organismen zu charakterisieren.

Um auf der jahrzehntelangen Arbeit mit RNAP-resistenten Mutanten aufzubauen und gleichzeitig die Tendenz zu vermeiden, Antibiotika-Bindungsstellen durch die Linse der Resistenz zu charakterisieren, präsentieren wir eine vollständige Sammlung von Einzelrest-Mutanten der Rif-Bindungsstelle. Mit unserer Sammlung stellen wir fest, dass die Rif-Bindungsstelle überraschend veränderlich ist und dass funktionelle Mutationen nicht ausschließlich auf Rif-Resistenz zurückzuführen sind und ohne sättigende Mutagenese nicht vollständig erkannt werden können (Abb. 1 und 2 und erweiterte Daten Abb. 1–3). Wir erweitern das bekannte Rif-Resistom, indem wir feststellen, dass nahezu jede Substitution an den Positionen 516, 526 und 572 einen hohen Widerstand erzeugt (Abb. 2 und 3a). Viele dieser resistenten Mutationen kommen nicht natürlich vor, wahrscheinlich weil sie mehrere Nukleotidsubstitutionen erfordern. Darüber hinaus identifizieren wir eine einzelne Alpha-Helix, die eine entscheidende Rolle bei der Rif-Bindung spielt, wobei Mutationen entweder eine hohe Resistenz (S522 und H526) oder eine erhöhte Empfindlichkeit (L521 und T525) verursachen (Abb. 2 und 3a). Diese Daten liefern eine detaillierte genetische Kartierung der Ligand-Enzym-Wechselwirkungen, die für medizinische Chemiker, die an der Steigerung der Antibiotikawirksamkeit arbeiten, von Wert sein wird.

Wir entdecken Einzelrestmutationen von RNAP, die Rif in E. coli in ein bakterizides Medikament umwandeln (Abb. 3). Wir zeigen, dass diese Mutationen durch eine Verlängerung der Rif-Bindung wirken, da sich die mutierte Polymerase sowohl in vivo als auch in vitro nur langsam von der Rif-Behandlung erholt (Abb. 3d und erweiterte Daten, Abb. 4d). Das Verhalten anderer bakteriostatischer Arzneimittel bleibt unverändert (erweiterte Daten). Abb. 5e, f), die Mutanten weisen keinen Fitnessdefekt auf (Extended Data Abb. 2) und wir beobachten keine Neuprogrammierung der Genexpression (Extended Data Abb. 8 und 9a – c). In ähnlicher Weise sind Makrolide der nächsten Generation bakterizid, da sie eine höhere Affinität zum Ribosom haben als das ursprüngliche bakteriostatische Arzneimittel14,52.

Es wurde zuvor beobachtet, dass Mutanten zur Reparatur von DNA-Schäden eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Rif33 aufweisen. In dieser Arbeit beobachten wir direkt, dass Rif doppelsträngige DNA-Brüche an Promotoren verursacht, die SOS-Reaktion induziert und RifHS-Mutanten abtötet (Abb. 3 und Extended Data Abb. 5a–d und 6a–c). Wir zeigen, dass die bakterizide Wirkung in RifHS-Mutanten, denen die DSB-Reparatur fehlt, und auch in Wildtyp-recA-Zellen verstärkt ist, was darauf hindeutet, dass Rif die DNA auch in Wildtyp-Zellen schädigt, jedoch nicht in dem Ausmaß, dass es zum Zelltod führt (Abb. 3g). . In Übereinstimmung mit früheren Arbeiten stellen wir fest, dass die bakterizide Wirkung von Rif nicht von ROS abhängt (Extended Data Abb. 6d – f), was auf einen Mechanismus hinweist, der sich von anderen bakteriziden Antibiotika unterscheidet . Stattdessen beobachten wir, dass Rif nur dann DNA-Schäden verursacht und tötet, wenn sich Zellen aktiv replizieren (Abb. 3i und Extended Data Abb. 7). Es ist bekannt, dass am Promotor angehaltenes RNAP ein Hindernis für das Replisom darstellt und Transkriptions-Replikationskonflikte nachweislich schädliche Mutationen verursachen39,40. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Rif die DNA durch einen ähnlichen Mechanismus schädigt. Zukünftige Arbeiten müssen durchgeführt werden, um dieses Modell an anderen Bakterien zu testen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Verbesserung der Rif-Bindungsaffinität die Behandlungszeiten verkürzen und das antimikrobielle Wirkungsspektrum erweitern kann. Darüber hinaus könnte die Entdeckung, dass Rif über einen einzigartigen Mechanismus wirkt und DNA-Schäden verursacht, Einfluss auf die Entwicklung einer antimikrobiellen Kombinationstherapie haben.

Wir entdecken in unserer Sammlung weitere Einzelrestmutationen, die schnelles RNAP ergeben, ähnlich der gut charakterisierten Rif-resistenten H526Y-Mutante und anderen Mutanten von RNAP15,21,53. Wir beobachten, dass hohe Transkriptionsraten Pyrimidinnukleotide abbauen, sodass diese Mutanten besonders anfällig für einen weiteren Abbau durch 5FU-Hemmung von thyA54 werden (Abb. 4). Wichtig ist, dass mit Thymidin ergänzte Wachstumsmedien die 5FU-Empfindlichkeit von Fast RNAP wiederherstellen können (Abb. 4g). Wir stellen fest, dass eine Thymidin-Supplementierung die Zellen nicht vollständig resistent gegen 5FU macht. Ein falscher Einbau von dUTP und seinem 5-Fluoro-Analogon während der Replikation sowie ein falscher Einbau von 5FU während der Transkription können zu den antimikrobiellen Wirkungen von 5FU beitragen. Der Nukleotidabbau durch schnelles RNAP macht Zellen auch anfälliger für den Tod ohne Thymin (Extended Data Abb. 9f) und für das klinisch wichtige Antibiotikum Trimethoprim (Abb. 4h). Die Hochgeschwindigkeitstranskription sensibilisiert Zellen aufgrund der geringen Terminationseffizienz auch für das Antibiotikum BCM. Wir stellen jedoch fest, dass ein schlechter Abschluss einen Wachstumsvorteil bei niedrigeren Temperaturen bietet (Erweiterte Daten, Abb. 10c). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Transkriptionsgeschwindigkeit die Nukleotidverfügbarkeit bestimmt, die Antibiotikaempfindlichkeit verändern und die optimale Wachstumstemperatur von Bakterien verändern kann.

Trotz hoher evolutionärer Erhaltung der Rif-Bindungsstelle identifizieren wir funktionelle RNAP-Mutationen, die in der Natur häufig vorkommen. 524L und 526N haben beide gemeinsame Eigenschaften mit schnellen RNAP-Mutanten und befinden sich auf der Alpha-Helix, die wir als wichtig für die Rif-Bindung identifiziert haben (Abb. 2 und 3). Daher bietet 526N einen hohen Rif-Widerstand und erhöht die Empfindlichkeit gegenüber 5FU, jedoch nicht im gleichen Maße wie 526Y (Erweiterte Daten, Abb. 3). Es ist faszinierend zu sehen, dass klinische Resistenzen, die sich relativ schnell entwickeln, höhere Fitnesskosten verursachen als Resistenzen, die sich über Millionen von Jahren der Evolution entwickelt haben. Es ist auch interessant zu spekulieren, warum Tenericutes und andere Phyla diese Mutation tragen würden. Möglicherweise lebten sie in unmittelbarer Nähe des Rif, der Bakterien produzierte. rpoB 567Q, das in 2 % der untersuchten Arten vorkommt, bietet eine hohe Resistenz sowohl gegen 5FU als auch gegen BCM. Wir stellen fest, dass Arten, die diese Mutationen tragen, in rauen Umgebungen leben, beispielsweise in hydrothermalen Quellen und im Verdauungstrakt von Tieren. Diese Mutationen standen nicht im Mittelpunkt dieses Artikels, aber es handelt sich wahrscheinlich um langsame, stringente Mutanten von RNAP, ähnlich wie 513P16 (Extended Data Abb. 9g,h), und wir spekulieren, dass sie die Toleranz gegenüber dem Leben unter nukleotid- oder nährstofflimitierenden Bedingungen erhöhen .

Insgesamt zeigt unsere hochauflösende Charakterisierung der Rif-Bindungsstelle mehrere RNAP-Subtypen, von denen einige in der Natur vorkommen. Wir finden RNAP, das äußerst empfindlich auf Rif reagiert und es in einem gramnegativen Bakterium durch einen einzigartigen Mechanismus der DNA-Schädigung in ein bakterizides Antibiotikum umwandelt. Wir stellen außerdem fest, dass die Transkriptionsgeschwindigkeit die Verfügbarkeit von Nukleotiden in der Zelle bestimmt und die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika verändern kann. Unsere Studie beleuchtet die Antibiotika-Bindungsstelle als multifunktionale Domäne essentieller Enzyme und inspiriert zu einer ähnlichen Charakterisierung anderer wichtiger Antibiotika-Ziele, um unser Verständnis der antibakteriellen Mechanismen, der bakteriellen Physiologie und der Evolution zu erweitern.

MAGE mit dem E. coli-Stamm EcNR21 wurde verwendet, um einen Pool von Einzelrest-Rif-Bindungsstellensubstitutionen zu erzeugen, die rpoB 510–537 und 563–572 umfassten. 760 MAGE-Oligos (Integrated DNA Technologies) wurden entwickelt, um 20 mögliche Einzelrest-Mutanten an 38 Positionen zu erzeugen. Um den Nachweis von Hintergrundmutationen einzuschränken und die Spezifität unseres Ansatzes weiter zu erhöhen, haben wir unsere MAGE-Bibliothek speziell so konzipiert, dass sie einzelne Codon-Substitutionen erzeugt, die nach Möglichkeit mehrere Nukleotidveränderungen umfassen. Eine einzelne Runde der MAGE-Mutagenese wurde in vier Behältern mit 510–518, 519–527, 528–537 und 563–572 durchgeführt. Die Zellen wurden über Nacht gewonnen und in Glycerin gelagert.

Um ein Screening-Experiment zu beginnen, wurden die Zellen aufgetaut, die Behälter kombiniert und man ließ sie sich auf eine OD bei 600 nm (OD600) von 0,4 erholen, woraufhin ein Aliquot als T0 genommen wurde. Die Zellen wurden dann einem „Wiederherstellungsformat“ für die Rif-Behandlung oder einem „MIC-Format“ für die BCM- oder 5FU-(Sigma)-Behandlung unterzogen. Im „Wiederherstellungsformat“ wurden die Zellen 1 Stunde lang mit 50 µg ml−1 Rif (Sigma) behandelt, mit LB gewaschen, zehnfach verdünnt und konnten sich vor der Verdünnung auf die OD erholen, bevor sie gesammelt wurden (T1-Arzneimittel). Im „MIC-Format“ wurden die Zellen zehnfach verdünnt und mit BCM (15 oder 30 µg ml-1) oder 5FU (1 oder 5 µg ml-1) behandelt und konnten sich vor der Verdünnung auf die OD erholen, bevor sie gesammelt wurden (T1-Arzneimittel). . Unbehandelte Zellen wurden parallel gezüchtet, um die Mutantenfitness (T1-Fitness) zu messen und zu kontrollieren. Unbehandelte Zellen wurden auch auf Agarplatten passagiert, indem die Zellen ausplattiert und die Kolonien nach einer Inkubation über Nacht abgekratzt wurden. Das gesamte Screening wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Das von uns verwendete Screening-Format hing vom ausgewählten Medikament ab. Da es sich bei Rif um ein bakteriostatisches Medikament handelt37, erwarteten wir nicht, dass die Häufigkeit empfindlicher Mutanten abnimmt. Glücklicherweise haben frühere Arbeiten gezeigt, dass Rif einen „postantibiotischen Effekt“ hervorruft, bei dem die Zellen eine Verzögerung der Erholung zeigen, nachdem Rif weggespült wurde und die Zellen ihr Wachstum wieder aufnehmen können55,56. Aus diesem Grund haben wir ein Wiederherstellungsformat entwickelt, bei dem mutierte rpoB-Pools zunächst mit Rif behandelt, gewaschen, zehnfach verdünnt und dann erholt wurden. Es ist zu erwarten, dass sich empfindliche Mutanten langsamer erholen und dann in geringerer Häufigkeit vorkommen. Da sowohl BCM als auch 5FU bakterizid sind37,54,57, erwarteten wir, dass empfindliche Mutanten sterben und in ihrer Häufigkeit abnehmen. Daher wurden für jedes Arzneimittel zwei Konzentrationen ausgewählt: eine Konzentration bei der MHK, bei der nur resistente Mutanten überleben würden, und eine bei einer niedrigeren Konzentration, bei der empfindliche Mutanten verloren gingen. Wir isolierten arzneimittelspezifische Effekte, indem wir die Mutantenhäufigkeit zwischen mit Arzneimittel behandeltem (T1-Arzneimittel) und unbehandeltem Arzneimittel (T1 LB) normalisierten.

Genomische DNA wurde aus gesammelten Zellen mit dem Monarch Genomic DNA Purification Kit (NEB) hergestellt. Die Bibliotheken wurden in zwei Behältern bestehend aus rpoB 510–537 und 563–572 vorbereitet. Hier wurden 100 ng DNA zunächst zwei PCR-Zyklen in einer 50-µl-Reaktion mit Q5-Polymerase (NEB) und 1 µM Primern (Ergänzungstabelle 2) unterzogen, um einen eindeutigen Barcode aus 14 degenerierten Nukleotiden anzufügen, um PCR-Duplikate während der Analyse zu korrigieren. Nach dem Anbringen des Barcodes wurden die Reaktionen 1 Stunde lang bei 37 °C mit 1 µl Exonuklease I (NEB) behandelt, um nicht verwendete Barcodes zu entfernen. Anschließend wurde die DNA mit einem 1,5-fachen Verhältnis von PCRClean DX-Kügelchen (Aline Biosciences) gereinigt. Anschließend wurden Proben-Barcode-Indizes und Sequenzierungsadaptersequenzen mit 18 Zyklen exponentieller PCR angehängt, bevor zwei Reinigungsrunden mit einem 1-fachen Perlenverhältnis durchgeführt wurden. Die Bibliotheken wurden mit der Novaseq 6000 SP300-Kassette (Illumina) sequenziert, mit dem Ziel, 40 Millionen Lesevorgänge pro Bibliothek und 2 × 106 eindeutige Barcodes für jede experimentelle Probe zu sammeln, was die Beobachtung von 20–20.000 Instanzen jeder Mutante ermöglichte.

Sequenzierungsadapter wurden mit CutAdapt58 zugeschnitten. Als nächstes wurden die Sequenzen nach korrekter Länge und Primersequenzen gefiltert und dann anhand der oben genannten Nukleotid-Barcodes in „Familien“ gruppiert. Familien, die ein ursprüngliches genomisches Molekül darstellen, wurden anhand des Nukleotids auf 80 % Konsens überprüft, wobei bei fehlendem Konsens standardmäßig auf die Wildtyp-Sequenz zurückgegriffen und dann in die entworfene Aminosäuresequenz übersetzt wurde. Die Familien wurden nach Mutanten gruppiert und die Anzahl der Familien, die einem einzelnen Mutanten entsprachen, durch die Gesamtzahl der Familien dividiert, um die Mutantenhäufigkeit zu ermitteln. Für die Analyse wurden nur Einzelrestmutanten berücksichtigt. Um die Mutantenfitness zu bestimmen, wurden die Mutantenhäufigkeiten nach dem Wachstum (T1-Fitness) auf die Häufigkeiten vor dem Wachstum (T0) normalisiert. Um arzneimittelspezifische Wirkungen zu bestimmen, wurden die Mutantenhäufigkeiten nach medikamentöser Behandlung (T1-Arzneimittel) auf die Häufigkeiten nach Wachstum in LB (T1-Fitness) normalisiert.

Für alle Validierungsexperimente wurde Wildtyp-E. coli MG1655 als Elternstamm verwendet (Ergänzungstabelle 1). Um ausgewählte rpoB-Mutanten für die Rekonstruktion in MG1655 zu erzeugen, verwendeten wir MAGE, um eine Kanamycin-Kassette am 3'-Ende von rpoC im E. coli-EcNR2-Stamm einzuführen. Ausgewählte rpoB-Mutanten wurden im resultierenden E. coli EcNR2 rpoc:kn erzeugt. P1-Phagen-vermittelte Transduktion wurde verwendet, um Mutanten zu MG1655 zu bewegen. Für Knockout-Stämme wurde pKD46 wie zuvor beschrieben59 verwendet.

Übernachtkulturen der angegebenen, in LB gezüchteten Stämme wurden 10.000-fach verdünnt und das Wachstum in 0,2 ml LB wurde bei 37 °C in einem Bioscreen C-Gerät (Growth Curves USA) überwacht. MHK-Werte wurden als minimale Antibiotikakonzentration für eine Wachstumshemmung von mehr als 90 % nach 15 Stunden definiert. Für MHK- und MBC-Tests gemäß klinischen Standards60 wurde ein anfängliches Inokulum von 5 × 105 Zellen mit steigenden Rif-Konzentrationen in Mueller-Hinton-Brühe 18 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die MHK wurde bestimmt, wenn basierend auf der OD600 mindestens 90 % des Bakterienwachstums gehemmt wird. Der MBC wurde als die niedrigste Konzentration eines antibakteriellen Wirkstoffs bestimmt, die die Lebensfähigkeit des anfänglichen Bakterieninokulums nach 18 Stunden bei 37 °C um mindestens 99,9 % verringert.

In LB gezüchtete Übernachtkulturen der angegebenen Stämme wurden 1.000-fach verdünnt und in 2 ml Medium bis zu einer OD600 von 0,2 gezüchtet, bevor die angegebene Konzentration an Rif (Sigma), Ampicillin (Sigma), Chloramphenicol (Sigma) und Tetracyclin zugegeben wurde (Sigma), 2,2′-Dipyridyl (Sigma) oder Thioharnstoff (Sigma). Nach einer Stunde Behandlung wurden die Zellen zweimal mit einem gleichen Volumen LB gewaschen. Es wurden Reihenverdünnungen der gewaschenen Zellen hergestellt und entweder auf LB-Agar ausplattiert oder zur Wachstumsüberwachung in ein Bioscreen C-Gerät gegeben. Für Thymidin-Supplementierungsexperimente wurde LB-Agar mit der angegebenen Konzentration an Thymidin (Sigma) und 5FU (Sigma) ergänzt. Für Replikationsblockexperimente wurden Stämme im PC2-Hintergrund konstruiert, die ein temperaturempfindliches Allel des DNA-Replikationsproteins dnaC39,42 tragen. Die Zellen wurden wie angegeben bis zu einer OD600 von 0,2 bei 30 °C gezüchtet, bevor sie 1,5 Stunden lang auf 42 °C umgestellt wurden. Anschließend wurden die Zellen 30 Minuten lang zu Medien mit 80 µg ml–1 Rif gegeben, die auf 42 °C vorgewärmt waren, bevor sie gewaschen und auf LB-Agar ausplattiert wurden. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde berechnet, indem die Anzahl der behandelten auf unbehandelte Kolonien normalisiert wurde.

Die rpoB-Mutante wurde zur rekombinanten Expression und Reinigung von E. coli-Kern-RNAP wie zuvor beschrieben auf den PVS10-Vektor kloniert61. Mehr als 3 pmol RNAP-Kern wurden mit äquimolarer σ70- und Matrizen-DNA mit der Sequenz: tccagatcccgaaaatttatcaaaaagagtattgacttaaagtc taacctataggatacttacagccATCGAGAGGGCCACGGCGAACAGCCAACCCAATCGAACAGGCCTGCTGGTAATCGCAGGCCTTTTTATTTGGATCCCCGGGTA (Großbuchstaben bezeichnen die transkribierte Sequenz) in 20 µM gemischt l TB50-Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8; 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 0,03 % Igepal-60) und 5 Minuten bei 37 °C inkubiert. Zusammengesetzte Transkriptionskomplexe wurden dann mit 2 µl Rif (20 µg ml–1) behandelt und 5 Minuten bei 37 °C inkubiert, bevor sie in 10 µl NeutrAvidin-Kügelchen (Fisher) übertragen und 5 Minuten bei 25 °C geschüttelt wurden. Die Proben wurden viermal mit 1 ml TB50 gewaschen. Adenosintriphosphat (ATP), Guanosintriphosphat (GTP), Uridintriphosphat (UTP) und 5 µM Cytidintriphosphat (CTP), vorgemischt mit CTP-αP32, wurden auf 1 mM zugegeben und bei 37 °C inkubiert. Dann wurden 10 µl-Aliquote nach 3, 5, 10, 20, 30 oder 40 Minuten entnommen und mit SB (1× Tris-Borat-EDTA (TBE); 20 mM EDTA; 8 M Harnstoff; 0,025 % Xylolcyanol, 0,025 % Bromphenolblau), 5 Min. auf 100 °C erhitzt und auf ein 30 % (20 × 20 cm2) (19:1) Polyacrylamidgel mit 7 M Harnstoff und TBE-Vorlauf für 6 Min. aufgetragen. Das Gel wurde 50 Minuten lang bei 50 W laufen gelassen, bevor es zur Belichtung über Nacht auf einen Röntgenfilm übertragen wurde. Die Gelintensität wurde mit GelQuant.NET quantifiziert.

Übernachtkulturen von rpoB-Wildtyp-rpoC-10X-His und rpoB T525D-rpoC-10X-His wurden 1.000-fach verdünnt und vor der Zugabe von 80 µg ml–1 in 25 ml LB bei 37 °C auf eine OD600 von 0,2 gezüchtet Rif. Nach einstündiger Behandlung wurden die Zellen einmal in einem gleichen Volumen LB gewaschen. Den Zellen wurde erlaubt, sich 1 Stunde lang in LB bei 37 °C zu erholen, bevor sie 20 Minuten lang mit 1 % Formaldehyd bei 37 °C vernetzt wurden. Zum Abschrecken der Reaktion wurde eine Endkonzentration von 250 mM Glycin zugegeben. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei × 5.000 g gesammelt und zweimal mit eiskalter 1 phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, bevor sie in 1 ml Lysepuffer (10 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA) resuspendiert wurden. 0,1 % Natriumdesoxycholat, 0,5 % N-Lauroylsarcosin) plus 2 mg ml−1 Lysozym mit Proteaseinhibitor (Roche) und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die DNA wurde mit einem Ultraschallgerät Covaris M220 in einem 10-s-Ein-/10-s-Aus-Zyklus über insgesamt 50 Zyklen geschert. Der Überstand wurde mit 5 µg ml–1 6X-His-tag-Antikörper (Proteintech) inkubiert und über Nacht bei 4 °C inkubiert.

Dann wurden 50 µl Protein A/G-Kügelchen pro Probe mit 1 ml eiskaltem 1× PBS + 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) voräquilibriert und mit den Proben 0,5 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Die Proben wurden fünfmal in 1 ml RIPA-Puffer (50 mM HEPES pH 7,5, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 1 % NP40, 0,7 % Natriumdesoxycholat) gewaschen und abschließend in 1 × TE (100 mM Tris-Cl) gewaschen pH 8, 10 mM EDTA pH 8). Die Komplexe wurden in 250 µl 1× TE + 4 µl RNAseA für 1 Stunde bei 37 °C entquert und dann über Nacht bei 65 °C mit 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1 mg ml-1 Proteinase K belassen gereinigt mit ChIP Clean and Concentrate (Zymo). ChIP-Experimente wurden in zweifacher Ausfertigung durchgeführt.

Für die Sequenzierung wurden Probenbibliotheken mit dem NEBNext ChIP–seq Library Kit (NEB) gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Zur Qualitätskontrolle wurden die Bibliotheken auf der TapeStation 2200 (Agilent) überprüft. Die Proben wurden auf NextSeq 2000 (Illumina) sequenziert. Für die Ausrichtung bzw. Analyse wurden Bowtie62 und Deeptools63 verwendet.

Für DNA-Fragmentierungsexperimente wurden Zellen aus Übernachtkulturen 1.000-fach verdünnt und in 2 ml Medium bis zu einer OD600 von 0,2 gezüchtet, bevor 80 µg ml–1 Rif oder 125 ng ml–1 Norfloxacin zugegeben wurden. Nach einer Stunde Behandlung wurden die Zellen zweimal mit einem gleichen Volumen LB gewaschen, bevor sie mit 4 % Formaldehyd für terminales Desoxynukleotid TUNEL fixiert wurden. Die Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit dem Apo-Direct Kit (BD Bioscience) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Proben wurden mit einem FACSCalibur-Durchflusszytometer (BD Biosciences) gesammelt und für jede Probe wurden mindestens 50.000 Zellen gesammelt. Der Prozentsatz der TUNEL-positiven Zellen für eine bestimmte Erkrankung ist der Prozentsatz der Zellen, die das in mehr als 99 % der unbehandelten Zellen festgestellte Signal überschreiten.

Die Anzahl der DSBs in der genomischen DNA wurde mittels SLR-qPCR38 bestimmt. SLR-qPCR kann zum Nachweis von Läsionen oder Strangbrüchen verwendet werden, die eine Barriere für die Amplifikation durch DNA-Polymerase bilden64. Um DSBs in genomischer DNA zu quantifizieren, wurden die angegebenen Stämme in LB geimpft. Übernachtkulturen der angegebenen Stämme wurden 1.000-fach in LB verdünnt und bei 37 °C bis zu einer OD600 von 0,2 wachsen gelassen. Die Zellen wurden entweder mit Rif (80 µg ml–1) oder dem Trägerlösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) 1 Stunde lang bei 37 °C behandelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und zweimal mit PBS gewaschen. Genomische DNA wurde mit einem Monarch Genomic DNA Isolation Kit (NEB) isoliert.

Die Reaktionsmischung enthielt 1× SYBR Green Mix (Applied Biosystems), 500 nM jedes Primers und 1 ng Template-DNA in einem Gesamtvolumen von 20 µl pro Vertiefung. Zwei Primersätze (Ergänzungstabelle 3), die ein kurzes und ein langes Amplifikat ergeben, liefern Daten, die die Gesamtmenge an Matrize (eine interne Normalisierungskontrolle) bzw. unbeschädigte DNA darstellen. Die beiden Primerpaare hatten eine vergleichbare Amplifikationseffizienz und ergaben laut Agarosegelanalyse ein einziges PCR-Produkt. Die Datenanalyse erfolgte wie beschrieben38 unter Verwendung einer modifizierten Version der 2−ΔΔCT-Methode. Die DSB-Dichte wurde unter Verwendung genomischer DNA aus unbehandelten Zellen als Referenz gemessen. Der DNA-Schaden wurde als DSB pro 10 Kilobasen DNA berechnet.

Für Replikationsblockexperimente wurde ein duales Plasmidsystem, das dCas9 exprimiert, und eine auf den oriC abzielende Leit-RNA in die Zellen von Interesse eingeführt, wie bereits berichtet41. Die Zellen wurden wie oben beschrieben bei 37 °C bis zu einer OD600 von 0,2 gezüchtet und dCas9 wurde 30 Minuten lang mit 200 ng ml−1 Tc induziert, bevor Rif hinzugefügt wurde.

Die Zellen wurden aus Übernachtkulturen 1.000-fach verdünnt und bis zu einer OD600 von 0,2 in 2 ml Medium vor der Zugabe von 80 µg ml–1 Rif oder 10 µg ml–1 Ampicillin gezüchtet. Die Zellen wurden 30 Minuten lang mit Antibiotikum inkubiert, bevor 10 mM Carboxy-H2DCFDA (Thermo) zugegeben wurden. Anschließend wurden die Zellen weitere 30 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden dann mit einem gleichen Volumen PBS gewaschen, hinsichtlich der Zellzahl normalisiert und auf eine undurchsichtige 96-Well-Platte übertragen, wonach die Fluoreszenzintensität mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen wurde. Zur Kontrolle der Hintergrundfluoreszenz wurde eine mit einem gleichen Volumen PBS beladene Blindvertiefung verwendet.

Die Zellen wurden aus Übernachtkulturen 1.000-fach verdünnt und bis zu einer OD600 von 0,2 in 2 ml Medium vor der Zugabe von 80 µg ml–1 Rif für 1 Stunde gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen gesammelt, in Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 4 % SDS) resuspendiert, mit 4 × Lithiumdodecylsulfat (LDS)-Probenpuffer (Invitrogen) gemischt und vor dem Laden 10 Minuten lang bei 95 °C gekocht auf einem NuPAGE 4–12 % Bis-Tris-Fertiggel (Thermo) für die Elektrophorese bei 200 V für 40 Minuten. Das Gel wurde dann halbtrocken auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran (Millipore) übertragen und mit den angegebenen Antikörpern über Nacht bei 4 °C in SuperBlock T20-Blockierungspuffer (Thermo) inkubiert, bevor es am nächsten Tag entwickelt wurde. Als Antikörper wurden monoklonaler E. coli-RNAP-beta-Antikörperklon 8RB13-Maus-mAB im Verhältnis 1:2.000 (663905; Biolegend) und LexA-Antikörper (E-7) im Verhältnis 1:200 (sc-365999; Santa Cruz) verwendet. Die Gelintensität wurde mit GelQuant.NET quantifiziert.

RNA wurde aus Zellen hergestellt, die 1 Stunde lang mit 80 µg ml–1 Rif behandelt wurden, unter Verwendung von Trizol und Direct-zol RNA Microprep (Zymo). RT-qPCR wurde mit 100 ng RNA mit dem Luna RT-qPCR-Kit (NEB) und Quantstudio 7 (Applied Biosystems) durchgeführt, wobei Primer, die auf rpsL abzielten, als Kontrolle verwendet wurden (Ergänzungstabelle 5).

RNA-Sequenzierungsbibliotheken wurden aus in LB gezüchteten Mid-Log-Zellen mit dem NEB Ultra II Directional RNA Library Prep Kit für Illumina (NEB, E7760S) hergestellt. Die Lesevorgänge wurden mit Cutadapt gekürzt und dann mit Bowtie2 (Lit. 62) auf das E. coli-Genom ausgerichtet. DESeq2 (Lit. 65) wurde zur Analyse der differentiellen Expression verwendet.

In LB gezüchtete Mid-Log-Zellen wurden abzentrifugiert, mit PBS gewaschen und in 1 m resuspendiert; Trockeneisgekühlter Extraktionspuffer (50 % Methanol, 1 % Ameisensäure, 10 µM markiertes UTP; 13C9, 15N2), optimiert für die UTP-Extraktion. Die Zellen wurden in Beadblaster-Röhrchen (Benchmark Scientific) überführt und mit zehn Zyklen (30 s an, 30 s aus) homogenisiert. Homogenisierte Proben wurden in ein 2-ml-Glasfläschchen überführt und mit 0,4 ml Wasser in HPLC-Qualität und 0,8 ml Chloroform verwirbelt. Die Proben wurden dann 30 Minuten lang bei 4 °C inkubiert und der Überstand wurde abgetrennt und in einem SpeedVac (Thermo Scientific) getrocknet, bevor er in 40 µl Wasser in HPLC-Qualität resuspendiert wurde. Die resuspendierte Probe wurde dann zentrifugiert, um Trümmer zu entfernen, und in einen 250-µl-Glaseinsatz für die LC-MS-Analyse im Metabolomics-Kern der NYU überführt.

Die Transkriptionsverlängerungsraten wurden mit einem qPCR-Assay mit mehreren Sonden (Ergänzungstabelle 3) entlang des Lac-Operons gemessen, wie zuvor beschrieben . E. coli-Zellen wurden vor der Induktion durch 1 mM Isopropyl-beta-d-thiogalactopyranosid (IPTG) bis zu einer OD600 von 0,4 gezüchtet. Nach der Induktion wurden Aliquote in 10-s-Intervallen in ein Röhrchen entnommen, das eine auf –20 °C vorgekühlte Stopplösung (60 % EtOH, 2 % Phenol, 10 mM EDTA) enthielt. Die RNA wurde mit Trizol (Invitrogen) und dem Direct-zol RNA Microprep Kit (Zymo) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Anschließend wurden 100 ng Gesamt-RNA mithilfe von Superscript IV Reverse Transkriptase (ThermoFisher) und RNaseOut (ThermoFisher) in komplementäre DNA umgewandelt. Die Echtzeit-qPCR-Amplifikation wurde mit SYBR Green (Invitrogen) und Quantstudio 7 (Applied Biosystems) durchgeführt. Die Datenanalyse erfolgte wie zuvor beschrieben43.

NETseq-Bibliotheken wurden wie zuvor beschrieben4 vorbereitet und analysiert, mit Änderungen am Pause-Calling-Algorithmus. Pausen wurden unter Verwendung von 100-Nukleotid-Schiebefenstern aufgerufen, mit der Bedingung, dass die Pause das maximale Signal innerhalb des Fensters ist und das Signal 2 sd über dem Fenstermittelwert liegt.

Die KEGG-Orthologiedatenbank49 wurde nach Orthologen von E. coli rpoB durchsucht und auf ähnliche Weise analysiert wie zuvor mit rpoD28 durchgeführte Arbeiten. Kurz gesagt: Orthologe wurden nach bakteriellen Proteinen gefiltert, die eine ähnliche Länge wie E. coli rpoB aufwiesen, was 1.342 Sequenzen ergab. Als nächstes wurden die Sequenzen mit Clustal Omega66 abgeglichen und die Positionserhaltung durch Jensen-Shannon-Divergenz50 berechnet. Orthologe Varianten innerhalb der rpoB-Bindungsstelle wurden durch Vergleich mit E. coli MG1655 rpoB bestimmt und deren Anzahl und Häufigkeit berechnet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Sequenzierungsdaten sind über das NCBI Sequence Read Archive (SRA) unter PRJNA992395 verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der Code zur Analyse von MAGE-seq-Datensätzen wurde aus früheren Arbeiten übernommen28.

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Referenzen herunterladen

Wir danken P. Zappile vom NYU Genome Technology Center, das teilweise durch die Cancer Center Support Grant-Nr. unterstützt wird. P30CA016087, im Laura and Isaac Perlmutter Cancer Center. Wir danken Y. Siu und D. Jones vom NYU Metabolomics Core Resource Laboratory. Wir danken K. Alzoubi für die Hilfe bei der Datenvisualisierung. Diese Arbeit wurde von der Blavatnik Family Foundation (EN) unterstützt; Howard Hughes Medical Institute (EN); NIH-Stipendium R01GM126891 (EN); NYU Medical Scientist Training Program (KBY); und Public Health Service Institutional Research Training Award Nr. T32 AI007180 (KBY).

Abteilung für Biochemie und Molekulare Pharmakologie, Grossman School of Medicine der New York University, New York, NY, USA

Kevin B. Yang, Maria Cameranesi, Manjunath Gowder, Criseyda Martinez, Yosef Shamovsky, Vitaliy Epshtein, Zhitai Hao, Thao Nguyen, Eric Nirenstein, Ilya Shamovsky, Aviram Rasouly und Evgeny Nudler

Howard Hughes Medical Institute, New York University School of Medicine, New York, NY, USA

Aviram Rasouly & Evgeny Nudler

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KBY und AR führten die in den Abbildungen dargestellten MAGE-Experimente durch. 1–3 und erweiterte Datenabbildungen. 1–3. KBY führte die Datenanalyse und Visualisierung der in den Abbildungen dargestellten MAGE-Daten und Evolutionsanalysen durch. 1–5 und erweiterte Datenabbildungen. 1–3. KBY, AR und MC bereiteten die Stämme vor und führten die in den Abbildungen dargestellten Validierungsexperimente durch. 3 und 4 und erweiterte Datenabbildungen. 5–9. CM führte die in Abb. 3 dargestellten Durchflusszytometrie-Experimente durch. MG führte die in Abb. 3 dargestellten SLR-qPCR- und Transkriptionskinetik-Experimente durch. 3 und 4 und Extended Data Abb. 7. ZH gereinigte Proteine ​​und VE führten In-vitro-Transkriptionstests durch, dargestellt in Extended Data Abb. 4. YS führte die ChIP-seq-Experimente durch, dargestellt in Abb. 3. TN führte Western Blots durch, dargestellt in Extended Data Abb. 4 6. E. Nirenstein führte die in den erweiterten Daten in Abb. 9 dargestellten MHK-Tests durch. IS führte eine Next-Generation-Sequenzierung durch. KBY, AR und E. Nudler haben das Projekt entworfen und das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren geschrieben. AR und E. Nudler betreuten das Projekt. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse.

Korrespondenz mit Aviram Rasouly oder Evgeny Nudler.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

ad, Repräsentative Heatmaps der relativen Mutantenhäufigkeiten aus dem MAGE-seq-Screening unter den folgenden Bedingungen: a, Zeitpunkte 0–2 (T0–2) und Platte. T0 stellt den anfänglichen MAGE-seq-Mutantenpool dar. T1 und T2 liegen nach aufeinanderfolgenden 100-fachen Verdünnungen vor, sodass die Zellen vor der Ernte die gleiche OD erreichen können. Die Platte stellt MAGE-seq-Bibliotheken dar, die aus Mutanten hergestellt wurden, die auf festem Medium (LB-Agar) passagiert wurden. b, Mutantenhäufigkeit nach Screening mit Rifampicin. c, Mutantenhäufigkeit nach Screening mit 15 (bcmlow) oder 30 ug/ml (bcmhigh) Bicyclomycin. d, Mutantenhäufigkeit nach Screening mit 1 (fulow) oder 5 ug/ml (fuhigh) 5-Fluorouracil. Die Zeilen entsprechen den rpoB-Positionen 510–537 und 563–572; Die Spalten entsprechen allen 20 Aminosäuren zusammen mit den Stoppcodons. Weiße Quadrate kennzeichnen Wildtyp-Reste. Jede Heatmap zeigt Werte aus dem Mittelwert von n = 3 biologisch unabhängigen MAGE-seq-Experimenten an.

Quelldaten

a, Fitnesslandschaft von rpoB-Mutanten im Vergleich von Zeitpunkt 1 mit Zeitpunkt 0. b, Vulkandiagramm der Mutantenpool-Fitness. Stoppcodons sind grau. Oben ist ein Diagramm zur Schätzung der Kerndichte der Mutanten-Fitnessverteilung dargestellt. c,d, Fitnesslandschaft und Vulkandiagramm von rpoB-Mutanten im Vergleich derjenigen, die Kolonien auf Agarplatten bilden, zum Zeitpunkt 0. Für (a) und (c) entsprechen die Zeilen der rpoB-Position und die Spalten allen 20 möglichen Aminosäuresubstitutionen, gruppiert nach Eigentum. Weiße Quadrate kennzeichnen Wildtyp-Reste. Rechts neben der Heatmap wird ein Balkendiagramm der durchschnittlichen Positionsfaltenänderung angezeigt. Alle MAGE-seq-Experimente wurden in n = 3 biologisch unabhängigen Replikaten durchgeführt. P-Werte werden mithilfe des unabhängigen t-Tests (zweiseitig) berechnet. Fehlerbalken geben 95 %-Konfidenzintervalle an.

Quelldaten

a–d, Heatmap-Zeilen entsprechen der rpoB-Position und Spalten entsprechen allen 20 möglichen Aminosäuresubstitutionen, gruppiert nach Eigenschaft. Weiße Quadrate kennzeichnen Wildtyp-Reste. Rechts neben der Heatmap wird ein Balkendiagramm der durchschnittlichen Positionsfaltenänderung angezeigt. e–h, Vulkandiagramme der Daten in (a–d). Alle MAGE-seq-Experimente wurden in n = 3 biologisch unabhängigen Replikaten durchgeführt. P-Werte werden mithilfe des unabhängigen t-Tests (zweiseitig) berechnet. Fehlerbalken geben 95 %-Konfidenzintervalle an.

Quelldaten

a, MA-Diagramm der Empfindlichkeit und Resistenz des MAGE-Mutantenpools gegenüber Rifampicin. Stoppcodons sind grau. b, Wachstumskurven der Genesung überempfindlicher Mutanten nach 1 Stunde Behandlung mit 80 µg/ml Rifampicin (n = 2). c, MHK überempfindlicher Stämme (p < 1e-5, 1e-5 von links nach rechts). Ein anfängliches Inokulum von 5 × 105 Zellen wurde mit steigenden Konzentrationen von Rifampicin in Mueller-Hinton (MH)-Brühe bei 37 °C 18 Stunden lang inkubiert. d, In-vitro-Transkriptionswiederherstellungsreaktion von Wildtyp- und rpoB-L521Y-RNAP nach Rifampicin-Behandlung und Waschen. Die Lage des Trimers und Terminators (69nt) ist mit Pfeilen gekennzeichnet. Unten ist ein Balkendiagramm des Intensitätsverhältnisses von Terminator/Trimer zu jedem Zeitpunkt als Durchschnitt zweier unabhängiger Experimente dargestellt. e, Repräsentativer Genom-Viewer des Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierungssignals (ChIP-seq) vom Wildtyp und rpoB-T525D-RNAP, normalisiert zur Eingabe. Die Zellen wurden nach einer einstündigen Erholung in LB nach einer einstündigen Behandlung mit 80 μg/ml Rifampicin gesammelt. Balkendiagramme und Wachstumskurven stellen den Mittelwert von n = 3 biologisch unabhängigen Experimenten dar, sofern nicht anders angegeben, wobei Fehlerbalken 95 %-Konfidenzintervalle angeben. P-Werte werden mithilfe des unabhängigen t-Tests (zweiseitig) berechnet.

Quelldaten

a, Lebensfähigkeit überempfindlicher Mutanten in Flüssigkeit nach 1-stündiger Behandlung mit Rifampicin. Zellen in der exponentiellen Phase wurden 1 Stunde lang bei 37 °C mit 80 μg/ml Rifampicin behandelt, bevor sie gewaschen, seriell verdünnt und auf Zellwachstum gemessen wurden (n = 9, p = 3,1e-2, 3,1e-4 von links nach rechts). ). b, Plattierungseffizienz überempfindlicher Mutanten nach 1-stündiger Behandlung mit MIC-normalisierten Rifampicin-Konzentrationen (p = 2,6e-3, 6,0e-4, 9,1e-4, 5,0e-4). Zellen in der exponentiellen Phase wurden mit dem 4-fachen oder 10-fachen ihrer jeweiligen minimalen Hemmkonzentration (MIC) von Rifampicin behandelt, bevor sie gewaschen, seriell verdünnt und ausplattiert wurden. c, Minimale bakterizide Konzentration (MBC) überempfindlicher Stämme (p < 1e-5, 1e-5). Der MBC wurde als die niedrigste Konzentration eines antibakteriellen Wirkstoffs bestimmt, die die Lebensfähigkeit des anfänglichen Bakterieninokulums nach 18 Stunden bei 37 °C um ≥99,9 % verringert. Rifampicin wurde bis zu der mit einem Sternchen gekennzeichneten Konzentration von 80 µg/ml getestet. d, MBC/MIC-Verhältnis bestimmt für Rifampicin-überempfindliche Stämme (p < 1e-5, 1e-5). e, Plattierungseffizienz überempfindlicher Mutanten nach 1-stündiger Behandlung mit Rifampicin, Chloramphenicol (CM) und Tetracyclin (TET) (p = 6,2e-1, 3,3e-1, 5,5e-1, 7,1e-1). Zellen in der exponentiellen Phase wurden 1 Stunde lang bei 37 °C mit 80 μg/ml Rifampicin, 20 μg/ml Chloramphenicol oder 20 μg/ml Tetracyclin behandelt, bevor sie gewaschen, seriell verdünnt und auf LB ausplattiert wurden. f, Ausplattierungseffizienz überempfindlicher Mutanten in recA- oder recBCD-Knockout-Stämmen nach einstündiger Behandlung mit 20 µg/ml Tetracyclin bei 37 °C. Zellen in der exponentiellen Phase wurden 1 Stunde lang bei 37 °C mit 20 μg/ml Tetracyclin behandelt, bevor sie gewaschen, seriell verdünnt und auf LB ausplattiert wurden. Balkendiagramme stellen den Mittelwert von n = 3 biologisch unabhängigen Experimenten dar, sofern nicht anders angegeben, wobei Fehlerbalken 95 %-Konfidenzintervalle angeben. P-Werte werden mithilfe des unabhängigen t-Tests (zweiseitig) berechnet.

Quelldaten

a, Relative Expression von SOS-Antwortgenen als Reaktion auf eine einstündige Behandlung mit 80 µg/ml Rifampicin bei 37 °C mittels RT-qPCR. Die Daten wurden auf die Expression von rpsL und dann zwischen Rif und unbehandelten Bedingungen normalisiert (n = 5, p = 4,7e-4, 3,7e-3, 1,8e-2, 7,5e-3 von links nach rechts). b: Relative LexA-Proteinspiegel, gemessen durch Western Blot in exponentiell wachsenden überempfindlichen Mutanten nach einstündiger Behandlung mit 80 ug/ml Rifampicin bei 37 °C (p = 2,5 e-2, 3,2 e-2, 5,4 e-3). Die Daten werden auf die relativen RpoB-Proteinspiegel normalisiert. c, Repräsentativer Western-Blot der Daten in (b). d, Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) von mit Ampicillin oder Rifampicin behandelten Zellen, gemessen mit Carboxy-H2DCFDA (p = 5,8e-6). Exponentiell wachsende Zellen wurden 1 Stunde lang mit 80 µg/ml Rifampicin oder 10 µg/ml Ampicillin bei 37 °C behandelt. Carboxy-H2DCFDA wurde 30 Minuten vor der Probenentnahme hinzugefügt. e, Plattierungseffizienz von Wildtyp-Zellen, behandelt mit 10 µg/ml Ampicillin mit oder ohne Zusatz von 500 µM 2,2′-Dipyridyl und 150 mM Thioharnstoff (n = 5; p = 3,9e-4). f, Plattierungseffizienz überempfindlicher Mutanten nach 1-stündiger Behandlung mit 80 µg/ml Rifampicin mit oder ohne Zusatz von 500 µM 2,2′-Dipyridyl und 150 mM Thioharnstoff (p = 1,5e-4, 1,7e-4, 3,8e). -5, 1.7e-4). Balkendiagramme stellen den Mittelwert von n = 3 biologisch unabhängigen Experimenten dar, sofern nicht anders angegeben, wobei Fehlerbalken 95 %-Konfidenzintervalle angeben. P-Werte werden mithilfe des unabhängigen t-Tests (zweiseitig) berechnet.

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a, Schematische Darstellung der quantitativen Semi-Long-Range-PCR (SLR-qPCR) zum Nachweis von Doppelstrangbrüchen (DSB). Zwei Sätze von Primern, die ein kurzes und ein langes Amplifikat ergeben, liefern Daten, die die Gesamtmenge an Template (eine interne Normalisierungskontrolle) bzw. unbeschädigte DNA darstellen. Die DSB-Dichte wird unter Verwendung genomischer DNA aus unbehandelten Zellen als Referenz gemessen. Der DNA-Schaden wird als DSBs pro 10 kb DNA berechnet. b, Schematische Darstellung des SLR-qPCR-Primerdesigns rund um den Promotor und den Genkörper ausgewählter Gene. c, Schema für Replikationsblockexperimente: Ein duales Plasmidsystem, das dCas9 exprimiert, und eine Leit-RNA, die auf das oriC abzielt, wurde in die Zellen von Interesse eingeführt. dCas9 verhindert die Bindung von Replikationsinitiationsproteinen. dCas9 wurde vor der Zugabe von Rif 30 Minuten lang mit 200 ng/ml aTc induziert. d,e, Anzahl der DSB pro 10 Kilobasen am fepA- und ilvC-Promotor, gemessen mit SLR-qPCR nach 1-stündiger Behandlung mit 80 ug/ml Rifampicin mit oder ohne Replikation (p = 1,5e-2, 7,6e-3, 9,9e- 4, 3.0e-4, 2.3e-3, 8.6e-3 von links nach rechts). Die Replikation wurde unter Verwendung von dCas9 mit einer Guide-RNA, die auf das oriC abzielte, 30 Minuten lang blockiert, bevor Rifampicin hinzugefügt wurde. f, qPCR-Messung des oriC/ter-Verhältnisses überempfindlicher Mutanten im PC2-Hintergrund vor und nach der Verschiebung der Zellen auf 42 °C, normalisiert auf aktiv replizierende Wildtyp-Zellen bei 30 °C. Zellen mit einem niedrigeren oriC/ter-Verhältnis replizieren weniger (n = 4; p = 9,3e-4, 1,9e-4, 4,8e-4). g, Plattierungseffizienz überempfindlicher Mutanten in PC2 bei der replikationspermissiven Temperatur von 30 °C (p = 2,2e-4, 5,1e-5). Balkendiagramme stellen den Mittelwert von n = 3 biologisch unabhängigen Experimenten dar, sofern nicht anders angegeben, wobei Fehlerbalken 95 %-Konfidenzintervalle angeben. P-Werte werden mithilfe des unabhängigen t-Tests (zweiseitig) berechnet.

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a, Häufung der RNA-Expressionszahlen von rpoB-Mutanten mit erhöhter, verringerter oder unveränderter Empfindlichkeit gegenüber Bicyclomycin und 5-Fluouracil. Zellen wurden in LB gezüchtet und Proben wurden in n = 3 biologisch unabhängigen Replikaten gesammelt. Vulkandiagramme aus der RNAseq-Analyse finden Sie in der ergänzenden Abbildung 2. b, GO-Anreicherungsanalyse unterschiedlich regulierter Gene in Mutanten der Rifampicin-Bindungsstelle im Vergleich zu Wildtyp-E. coli. P-Werte werden mithilfe des einseitigen exakten Fishers-Tests mit Benjamini-Hochberg-Korrektur berechnet.

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a, Differenzielle Genexpression der Pyrimidin-De-novo-Biosynthese, Ribonukleotid-Salvage oder Desoxyribonukleotid-Salvage-Wege in den schnellen Mutanten rpoB 515Y und 527W im Vergleich zum Wildtyp, gemessen durch RNAseq. Statistisch signifikante Unterschiede (p < 01) werden blau dargestellt. RNAseq wurde in n = 3 biologisch unabhängigen Replikaten durchgeführt und zweiseitige p-Werte wurden unter Verwendung des Wald-Tests mit Benjamini-Hochberg-Korrektur berechnet. b,c, Plattierungseffizienz von 5-Fluorouracil-empfindlichen Mutanten vor einem Hintergrund von pyrD oder upp. Zellen aus Übernachtkulturen wurden seriell verdünnt und auf LB-Agarplatten mit den angegebenen Konzentrationen von 5FU in µg/ml ausplattiert. d, Purine und dTDP in 5-Fluorouracil-empfindlichen rpoB-Mutanten, nachgewiesen durch LCMS (n = 5; p = 4,5e-5, 5,4e-1, 6,4e-3, 7,1e-3, 6,8e-1, 7,5e -2, 1.1e-3, 3.9e-1, 8.8e-1 von links nach rechts). e, Wachstumskurven von rpoB 515Y im Vergleich zu Wildtyp-Zellen mit der Zugabe von 0, 0,1 oder 1 ug/ml Thymidin. Die Werte stellen den Mittelwert von 2 biologischen Replikaten dar. f, Plattierungseffizienz von 5-Fluorouracil-empfindlichen Mutanten in einem thyA-Hintergrund nach Thymidinmangel (p = 3,2e-3, 4,2e-3, 9,8e-3). g, Beschichtungseffizienz von rpoB 513P mit den angegebenen Konzentrationen von 5FU in ug/ml (p = 7,2e-6). h, Plattierungseffizienz von rpoB 513P in einem thyA-Hintergrund nach Thymidinmangel (p = 5,2e-4). Balkendiagramme und Wachstumskurven stellen den Mittelwert von n = 3 biologisch unabhängigen Experimenten dar, sofern nicht anders angegeben, wobei Fehlerbalken 95 %-Konfidenzintervalle angeben. P-Werte werden mithilfe des unabhängigen t-Tests (zweiseitig) berechnet.

Quelldaten

a, Wachstumskurven von 5-Fluorouracil-empfindlichen Mutanten, die bei 25 °C gezüchtet wurden. b: Wachstumskurven von rpoB-Mutanten, geschichtet nach 5-Fluourouracil-Empfindlichkeit bei 25 °C und 42 °C. c, Wachstumskurven von Wildtyp-Zellen mit subinhibitorischem Bicyclomycin, gezüchtet bei 25 °C. Sofern nicht anders angegeben, stellen die Wachstumskurven den Mittelwert von n = 3 biologisch unabhängigen Experimenten dar, wobei Fehlerbalken 95 %-Konfidenzintervalle angeben. d, Streudiagramme der evolutionären Erhaltung und der durchschnittlichen Positionsfitness, Resistenz oder Empfindlichkeit für jede Restposition. Lineare Regressionslinien und 95 %-Konfidenzintervalle werden überlagert.

Quelldaten

Ergänzende Abbildungen. 1 und 2, die die Gating-Strategie für Abb. 3 und Vulkandiagramme für RNAseq-Daten im Zusammenhang mit Extended Data Abb. 8 enthalten, sowie die Ergänzungstabellen 1–5, in denen die in der Studie verwendeten Stämme und Primer aufgeführt sind.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yang, KB, Cameranesi, M., Gowder, M. et al. Hochaufgelöste Landschaft einer Antibiotika-Bindungsstelle. Natur (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06495-6

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Eingegangen: 03. August 2022

Angenommen: 28. Juli 2023

Veröffentlicht: 30. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06495-6

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