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Jul 02, 2023

Quantifizierung der Aufnahme fluoreszierender Nanopartikel in Säugetierzellen mithilfe eines Plattenlesegeräts

Scientific Reports Band 12, Artikelnummer: 20146 (2022) Diesen Artikel zitieren 1988 Zugriffe 1 Zitate 5 Details zu altmetrischen Metriken Im Einklang mit der raschen Ausbreitung von Nanopartikelanwendungen,

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 20146 (2022) Diesen Artikel zitieren

1988 Zugriffe

1 Zitate

5 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Im Einklang mit der raschen Ausweitung der Nanopartikelanwendungen sind verschiedene Werkzeuge erforderlich, um zu untersuchen, wie Nanopartikel mit biologischen Einheiten interagieren. Es wurden viele Tests entwickelt, um die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln zu messen, aber bisher sind die meisten Methoden aufwendig und oft nicht quantitativ. Hier haben wir eine leicht zugängliche und robuste quantitative Messmethode für den Grad der zellulären Aufnahme fluoreszierend markierter Nanopartikel mithilfe eines Plattenlesegeräts entwickelt. Im Versuchsdesign wurden potenzielle Probleme identifiziert und behoben, die zu Messabweichungen führen könnten. Beispielsweise wurde die Variation der Fluoreszenzintensität von Proben aufgrund von Unterschieden in der Zellzahl auf die optische Dichte normiert, bei der es sich um einen physikalischen Wert handelt, der der Zellzahl entspricht. Die Anzahl der Waschvorgänge und die Probenhandhabungstemperatur wurden optimiert, um die Beeinträchtigung durch verbleibende Nanopartikel bzw. einen möglichen Ausfluss von Nanopartikeln aus den Zellen zu minimieren. Der entwickelte Assay wurde mit der Lymphozyten-Zelllinie Jurkat demonstriert, um die zelluläre Aufnahme von fluoreszierend markierten 50-nm-Polystyrolkügelchen zu messen, und seine Anwendbarkeit wurde mit der Lungenkarzinom-Zelllinie A549 und einer weiteren Lymphozyten-Zelllinie RPMI8226 weiter bestätigt.

Die jüngsten Entwicklungen in der Nanotechnologie bieten vielfältige Möglichkeiten im Gesundheitswesen1, in der Lebensmittelindustrie2 und in der Kosmetikindustrie3, geben aber auch Anlass zur Sorge hinsichtlich einer möglichen Toxizität4,5. Um die Leistung und Sicherheit von Nanomaterialien zu untersuchen, müssen wir ihren Lebenszyklus verstehen, der aus Begegnung und Erkennung – Internalisierung – Handel – Verteilung – und Ausfluss über verschiedene biologische Experimente besteht. Die Aufnahme von Nanopartikeln ist ein umfassender Prozess, der Begegnung, Erkennung und Verinnerlichung umfasst6. Abhängig von der Verwendung muss die Aufnahmemenge moduliert werden, um entweder die Abgabe zu erhöhen oder eine wahllose Aufnahme zu vermeiden. Beispielsweise sollte bei medizinischen Anwendungen die Clearance von Nanopartikeln durch Makrophagen vermieden werden7, die Effizienz der Nanopartikelabgabe an ein Zielorgan sollte jedoch verbessert werden. Eine breite Palette von Studien zur Aufnahme von Nanomaterialien wurde mit Säugetierzellen7,8,9, Prokaryoten10 und Pflanzen11 durchgeführt, um nur einige zu nennen. Die zelluläre Aufnahme wird durch viele verschiedene Parameter6,12 gesteuert, wie etwa die physikalischen Eigenschaften von Nanopartikeln, einschließlich Größe, Form und Oberflächenladung, sowie die experimentellen Bedingungen, einschließlich Zelltypen13 und Zellzyklus14. Es besteht sogar eine Variabilität von Zelle zu Zelle bei der Aufnahme von Nanopartikeln, wie in einem anspruchsvollen Experiment von Åberg et al.15 gezeigt wurde.

Zur Quantifizierung der Aufnahme von Nanomaterialien wurden zahlreiche Analysen durchgeführt16. Am häufigsten werden Techniken verwendet, die auf Elektronen-17,18,19 oder Lichtmikroskopie20,21 basieren. Messungen optischer Eigenschaften wie Streuung und Fluoreszenz wurden auch zur Quantifizierung mit Durchflusszytometern8,10,14 und Mikroplatten-Lesegeräten19,22,23,24,25,26,27 eingesetzt. Auf induktiv gekoppeltem Plasma (ICP) basierende Techniken wie ICP-Massenspektrometrie28 und ICP-Atomemissionsspektroskopie26,29 sind ein weiteres nützliches Werkzeug zur Quantifizierung von Nanopartikeln in Zellen, sie sind jedoch destruktiv und nur auf Metallpartikel anwendbar. Andere Techniken wie Transmissionsröntgenmikroskopie, Ganzzelltomographie und hyperspektrale Bildgebung wurden ebenfalls übernommen, ihre Anwendungen sind jedoch begrenzt. Obwohl es eine Reihe von Techniken zur Quantifizierung von Nanopartikeln in Zellen und Geweben gibt, sind zuverlässigere, reproduzierbarere und vergleichbarere Techniken, die auch häufig verwendet werden, immer noch gefragt30.

Plattenlesegeräte kommen in zahlreichen Messanwendungen zum Einsatz, die von kleinen Metallionen31 bis hin zu Zellsphäroiden reichen. Ihre multimodalen und Hochdurchsatzfähigkeiten haben die Entwicklung verschiedener zellbasierter Analysen einschließlich Proliferations-, Todes-, Enzymaktivitäts- und anderer phänotypischer Tests erleichtert. Die Kombination mit den jüngsten Fortschritten bei Flüssigkeitshandhabungs- und Umgebungskontrollsystemen hat anspruchsvollere dynamische Analysen ermöglicht. Plattenlesegeräte sind vor allem einfach zu bedienende und vielseitig einsetzbare Geräte, die keine besonderen Fähigkeiten erfordern.

Unter den häufig gemessenen optischen Eigenschaften wird Fluoreszenz häufig in biologischen Tests verwendet, da sie die Analyse biologischer Moleküle auch bei geringen Konzentrationen ermöglicht und außerdem zahlreiche Optionen zur Auswahl bestimmter fluoreszierender Moleküle in Abhängigkeit von ihrer Wellenlänge bietet. An Nanopartikel konjugierte fluoreszierende Moleküle dienen als Reporter, um den Ort und die Funktion der Partikel zu untersuchen. In unserer vorherigen Arbeit32 haben wir einen Nanopartikel-Aufnahmetest mithilfe der Durchflusszytometrie entwickelt, mit dem wir den Grad der Aufnahme fluoreszenzmarkierter Silica-Nanopartikel durch Messung der Fluoreszenzintensität einer Zellpopulation quantifizierten. In diesem Assay kann die Intensität für einen Vergleich zwischen verschiedenen Versuchsreihen auf Moleküle äquivalenter löslicher Fluorophore kalibriert werden.

Plattenlesegeräte wurden eingesetzt, um die zelluläre Aufnahme verschiedener Nanopartikel wie Polystyrol9,23, Silber19, Chitosan24, Silica25 und Quantenpunkte26 zu quantifizieren. Zur Quantifizierung wurden häufig die Menge an Nanopartikeln pro Zellzahl9,23 oder die Menge an Protein24,25 und die Aufnahme relativ zu Kontrollproben19,26 ermittelt. Bei den meisten Tests wurden lysierte Zellen statt gewaschener Zellen verwendet, was eine weitere nachgelagerte Analyse schwierig machte. Diese veröffentlichten Arbeiten zeigen, dass der Mikroplatten-Reader ein nützliches Werkzeug für Nanopartikel-Aufnahmetests ist, in vielen Fällen fehlten jedoch Untersuchungen zu experimentellen Details und zur Zuverlässigkeit der Methoden.

In der aktuellen Arbeit konzentrieren wir uns auf die Entwicklung eines robusten und zuverlässigen, aber dennoch leicht zugänglichen Nanopartikel-Aufnahmetests ohne Zelllyse unter Verwendung eines Plattenlesegeräts. Zu diesem Zweck haben wir zunächst potenzielle Probleme antizipiert, die im experimentellen Verfahren auftreten können, und dann den Assay speziell für die Behebung solcher Probleme entwickelt. Anschließend implementierten wir die Methode mit einer menschlichen Lymphozytenzelllinie, Jurkat, und fluoreszierend markierten Polystyrol-Nanopartikeln und führten ein Kreuzverhör mit unserem zuvor entwickelten Assay auf Basis eines Durchflusszytometers durch. Schließlich haben wir den Assay zur weiteren Validierung auf eine adhärente Zelllinie, A549, sowie auf eine andere Suspensionszelllinie, RPMI8226, angewendet.

In dieser Arbeit wollten wir einen zuverlässigen, robusten und auch leicht zugänglichen Assay zur Quantifizierung der Aufnahme fluoreszierender Nanopartikel in Säugetierzellen mithilfe eines Plattenlesegeräts entwickeln. Zu diesem Zweck haben wir zunächst versucht, Schlüsselfaktoren zu identifizieren, die sich auf die Anzeigewerte auswirken würden, und diese zu untersuchen, um eine zuverlässige Messung zu erreichen. Abbildung 1 fasst den experimentellen Ablauf des entwickelten Assays zusammen. Der Assay besteht im Wesentlichen aus drei Schritten: (1) Kultivieren von Zellen und Behandeln mit fluoreszierenden Nanopartikeln in einer 6-Well-Platte, (2) Waschen der mit Nanopartikeln behandelten Zellen und Aliquotieren der gewaschenen Zelllösung in einer 96-Well-Platte und (3 ) Ablesen der Fluoreszenzintensität der Zelllösung mit einem Plattenlesegerät und Analysieren der Ergebnisse.

Gesamtes experimentelles Verfahren zur Analyse der Nanopartikelaufnahme, einschließlich Zellaussaat, Nanopartikelbehandlung, Zellernte und -waschen sowie Plattenablesung und -analyse.

Der erste von uns festgestellte Einfluss auf die Zuverlässigkeit der Messergebnisse ist der Unterschied zwischen den Zellzahlen zwischen den biologischen und technischen Dreifachproben in der 96-Well-Platte, der größtenteils auf die Zellhandhabung zurückzuführen ist. Der zweite Grund ist das mögliche Vorhandensein von Nanopartikeln in der Zelllösung durch unzureichendes Waschen. Verbleibende Nanopartikel führen zu einer Verzerrung der gemessenen Fluoreszenzintensität, die direkt als Grad der Nanopartikelaufnahme angesehen werden kann. Der dritte wesentliche Faktor ist der Verlust des Fluoreszenzsignals der mit Nanopartikeln behandelten Zellen aufgrund des Ausflusses von Nanopartikeln, wenn das Zellkulturmedium, das die Nanopartikel enthält, durch einen Waschpuffer ersetzt wird. Um diese Probleme zu lösen und damit den Assay robuster zu machen, haben wir für jedes Problem eine sinnvolle Lösung entwickelt, die in den folgenden Abschnitten ausführlich vorgestellt wird. Mit unserem entwickelten Assay haben wir ihn auf drei Säugetierzelllinien angewendet – zwei Blutzelllinien, Jurkat und RPMI8226, und eine Lungenzelllinie, A549. Wir werden zunächst die experimentellen Ergebnisse der Jurkat-Zellen vorstellen, die hauptsächlich zur Entwicklung des Tests verwendet wurden, und dann die Ergebnisse der A549- und RPMI8226-Zellen.

Als Modellnanopartikel wählen wir 50 nm große, innengefärbte Polystyrol-Nanopartikel, PSNP50. Ihre nominale Größe und ihr durchschnittlicher z-Durchmesser in Basal- und Vollkulturmedien, gemessen durch dynamische Lichtstreuung (DLS), betrugen 50, 46,23 bzw. 83,63 nm (ergänzende Daten, Abb. S1). Der mittels Rastertransmissionselektronenmikroskopie (STEM) ermittelte durchschnittliche Durchmesser betrug 40,07 nm. Der mit DLS und EM gemessene Unterschied in der Partikelgröße von etwa 6 nm ist auf die breite Verteilung der Partikelgröße zurückzuführen. Wie im STEM-Bild und der Größenverteilungsgrafik gezeigt, war eine erhebliche Anzahl von Nanopartikeln (ca. 10 %) vorhanden, die kleiner als 30 nm waren. Das Zetapotential der Nanopartikel wurde mit – 47,30 mV bzw. – 13,50 mV im Basis- bzw. Vollkulturmedium gemessen.

Die Fluoreszenzintensität (FI) von PSNP50 wurde mittels Totalreflexionsmikroskopie (TIRF) analysiert. Der FI und seine Verteilung wurden mit denen von selbst synthetisierten FITC-markierten Silica-Nanopartikeln (SiO2NP) unterschiedlicher Größe verglichen, die wie zuvor beschrieben synthetisiert wurden32. Der durchschnittliche FI der PSNPs war niedriger als der von SiO2NPs ähnlicher Größe; Der FI der PSNPs zeigte jedoch eine engere Verteilung im Vergleich zu SiO2NPs, was darauf hindeutet, dass PSNPs für die quantitative Analyse der Nanopartikelaufnahme geeignet sind (ergänzende Daten, Abb. S2).

In unserem Assay messen wir die integrierte Fluoreszenzintensität eines Ensembles von Zellen in der Vertiefung, und die Intensität wird wiederum als Grad der Nanopartikelaufnahme bewertet. Idealerweise wird in jede Vertiefung die gleiche Anzahl an Zellen ausgesät und für jede Vertiefung wird die gleiche Probenbehandlung durchgeführt; In der Realität kann jedoch die Anzahl der Zellen zwischen den Wells einer 96-Well-Platte zur Messung der Fluoreszenzintensität variieren. Zu den Variationsquellen gehören das Pipettieren und die Rückgewinnungseffizienz bei der Zentrifugation, die wesentliche Schritte bei der Zellernte und dem Waschen sind. Wenn die Anzahl der Zellen zwischen verschiedenen Wells zu stark schwankt, ist der resultierende Aufnahmetest unzuverlässig. Daher ist es wünschenswert, die Fluoreszenzintensität im Analyseschritt mit der Zellzahl zu normalisieren. Während die Zellzählung mit Zählgeräten möglicherweise die beste Option ist, ist die Zählung der Zellen in mehreren Dutzend Proben zeitaufwändig und nicht einfach durchzuführen. Außerdem ist die Zellzahl in den einzelnen Vertiefungen möglicherweise nicht hoch genug, damit die meisten Zellzähler eine zuverlässige Messung liefern könnten. Andere auf Mikrotiterplatten basierende kolorimetrische Hochdurchsatztests zur Zellzahlschätzung, wie z. B. MTT-Tests, sind aufgrund von Störungen durch die fluoreszierenden Nanopartikel nicht mit unserem Test kompatibel. Daher haben wir in dieser Arbeit die optische Dichte (OD) der Zelllösung als Ersatz für die Zellkonzentration verwendet, um die Fluoreszenzintensität zu normalisieren.

Während die OD-Messung üblicherweise zur Überwachung des Bakterienzellwachstums33 verwendet wird, wurde sie in Säugetierzellkulturen selten eingesetzt34,35. Stattdessen wenden entsprechende Studien routinemäßig die direkte Zellzählung mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler oder indirekte Zellzählmethoden an, die die Stoffwechselaktivitäten von Zellen oder die DNA-Menge von Zellpellets messen. Messungen der OD wurden hauptsächlich durch die vielen Komponenten im Kulturmedium eingeschränkt, die die optischen Eigenschaften der Zelllösung beeinflussen. Allerdings wird in unserem Test das Kulturmedium während des Waschschritts fast vollständig entfernt und die Zellen in 1 × PBS resuspendiert, was uns erwarten lässt, dass die OD stark mit der Zellkonzentration korreliert.

Zunächst haben wir überprüft, ob die Nanopartikel die OD der Zelllösung beeinflussen können. Das Vorhandensein von Nanopartikeln mit weniger als 10 µg/ml trägt unabhängig von der Wellenlänge nicht zur OD bei. Im Fall von 100 µg/ml war die optische Dichte der Nanopartikel nicht vernachlässigbar und bei kürzeren Wellenlängen aufgrund des in Nanopartikeln eingebetteten grünen Farbstoffs stärker ausgeprägt (ergänzende Daten, Abb. S3). Dann haben wir ein Diagramm zwischen Zellzahl und OD erstellt, um die Korrelation zu sehen. Es wurden Reihenverdünnungen von Jurkat-Zellen im Bereich von 0,59 bis 9,3 × 105 Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen hergestellt und die ODs bei verschiedenen Wellenlängen im Bereich von 400 bis 650 nm in Abständen von 50 nm gemessen. Für eine präzise Zellzählung verwendeten wir Zählperlen und Durchflusszytometrie anstelle eines automatischen Zellzählers. Die Gating-Strategie ist in den Zusatzdaten Abb. S4 (A) zusammengefasst. Das Diagramm zwischen Zellzahl und OD zeigt eine ziemlich lineare Beziehung bei 600 nm mit R2-Werten über 0,99, wie in Abb. 2A dargestellt. Die Messung war reproduzierbar und die Steigungen aus zwei separaten Experimenten (graue und schwarze Kreise in Abb. 2A) waren nahezu identisch. Ähnliche Ergebnisse wurden für ODs erhalten, die bei anderen Wellenlängen erhalten wurden. Zusammenfassend können wir den Schluss ziehen, dass OD als Ersatzparameter für die Zellzahl zur Normalisierung der Fluoreszenzintensität verwendet werden kann, um so Abweichungen in der Zellzahl zwischen Wells auszugleichen. Bei allen getesteten Wellenlängen von 400 bis 650 nm war die Wirkung der Nanopartikel auf die OD im gemessenen Bereich nicht signifikant und die Linearität der Zellkonzentration und der OD war gut genug (Ergänzende Daten, Abb. S5). Daher wurde in nachfolgenden Experimenten die Wellenlänge von 600 nm für die Analyse ausgewählt, die durch den in dieser Arbeit verwendeten grünen Farbstoff weniger beeinflusst wird als kürzere Wellenlängen und üblicherweise zur Messung der Konzentration mikrobieller Zellen verwendet wird. Für die Normalisierung können kürzere Wellenlängen ausgewählt werden, um mögliche Störungen durch die Farbstoffmoleküle zu vermeiden, wenn Nanopartikel verwendet werden, die Farbstoffe mit längeren Wellenlängen enthalten.

(A) Korrelation zwischen Zellzahl und optischer Dichte, gemessen bei 600 nm und (B) FITC-Intensitätsänderung durch wiederholtes Waschen von Jurkat-Zellen.

Wie im Abschnitt zum experimentellen Design erläutert, können restliche Nanopartikel in der Zelllösung die Fluoreszenzmessung durch ein Plattenlesegerät beeinflussen. Durch mehrfaches Waschen der Zelllösung wird die vollständige Entfernung von Nanopartikeln sichergestellt. Es kann jedoch zu nachteiligen Auswirkungen kommen, wenn die Zellen über einen längeren Zeitraum serum- und nährstofffreien Umgebungen ausgesetzt werden, und es kann zu einem möglichen Ausfluss von Nanopartikeln aus den Zellen in den Waschpuffer kommen. Daher verwendeten wir anstelle kleinerer Waschmengen eine große Menge Waschpuffer, nämlich 5 ml pro Waschgang, für Zellen aus einer Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen, die etwa 5 × 105 Zellen enthielt. Um die Anzahl der Waschvorgänge zu optimieren, wurden die unterschiedlich oft gewaschenen Zellen anschließend Fluoreszenzmessungen mit einem Durchflusszytometer unterzogen. Bei zweimal gewaschenen Zellen wurde eine starke Abnahme des FITC-Signals im Vergleich zu der nach einer Wäsche beobachtet, nach einer dritten Wäsche wurde jedoch keine merkliche Abnahme des FITC-Signals beobachtet (Abb. 2B). Daher kamen wir zu dem Schluss, dass zwei Waschvorgänge ausreichten, um die Nanopartikel aus dem Kulturmedium zu entfernen und dementsprechend zuverlässige Ergebnisse des Plattenlesegeräts zu liefern. Darüber hinaus beobachteten wir eine allmähliche Abnahme der FITC-Intensität, wenn die Zellen bei Raumtemperatur in 1 × PBS belassen wurden, möglicherweise aufgrund des Nanopartikelausflusses von den Zellen in den Puffer. Es wurde berichtet, dass die Aufnahme von Nanopartikeln temperaturabhängig ist, wobei 4 °C nur die Bindung von Nanopartikeln an die Zellmembran ermöglicht und die Internalisierung hemmt36. Daher wurde die Probenhandhabung so weit wie möglich auf Eis durchgeführt, um einen Verlust des Fluoreszenzsignals zu verhindern.

Jurkat-Zellen in einer 6-Well-Platte wurden 24 Stunden lang mit Nanopartikeln im Bereich von 5 bis 100 µg/ml (5, 12,5, 25, 50 und 100) behandelt. Zunächst untersuchten wir, ob das Vorhandensein von Nanopartikeln entweder die Zellmorphologie, die Lebensfähigkeit oder die Proliferation beeinflusst. Wie in Abb. S6 gezeigt, wurde die Zellmorphologie unter einem Mikroskop überprüft und es wurden keine merklichen Veränderungen beobachtet. Die hohe Lebensfähigkeit der Zellen blieb erhalten und die Anzahl der mit unterschiedlichen Nanopartikelkonzentrationen behandelten Zellen war unabhängig von der Nanopartikelbehandlung ähnlich. Nach der Behandlung bereiteten wir biologische und technische Dreifachproben in einer 96-Well-Platte vor, wie im Versuchsschema beschrieben (Abb. 1). Unser Probenlayout in der 96-Well-Platte zum Plattenlesen ist in Abb. S7 dargestellt.

Wie in Abb. 3A gezeigt, stieg die FITC-Intensität der Jurkat-Zelllösung, gemessen mit einem Plattenlesegerät, mit zunehmender Konzentration der behandelten Nanopartikel. Obwohl die drei biologischen Replikate ähnliche Trends zeigten, gab es Unterschiede zwischen ihnen, und der CV betrug bis zu 9,41 % für die Probe mit 50 µg/ml. Wir haben die FITC-Intensität auf den OD-Wert derselben Vertiefung normalisiert, gemessen bei 600 nm (Abb. 3B). Nach der Normalisierung wurde die Variation zwischen den drei Replikatproben deutlich reduziert, wie in Abb. 3C gezeigt, wo der CV für die 50 µg/ml-Probe auf 3,63 % sank. Eine Abnahme des CV wurde bei allen Nanopartikelkonzentrationen beobachtet und war besonders deutlich bei den Proben mit höherer Konzentration. Die entsprechenden Roh- und Analysedaten für diese Versuchsreihe sind in der Zusatzdatentabelle S1 zusammengefasst. Für eine Kreuzvalidierung haben wir auch den in unserer vorherigen Arbeit entwickelten durchflusszytometerbasierten Nanopartikel-Aufnahmetest durchgeführt32. Lebende einzelne Jurkat-Zellen wurden gemäß der in den ergänzenden Daten in Abb. S4 (B) beschriebenen Strategie aktiviert und die mittlere FITC-Intensität aufgezeichnet. Wie in Abb. 3D dargestellt, zeigte die Durchflusszytometer-Messung einen sehr ähnlichen Trend wie unsere Plattenlesegerät-Messung. Wenn man bedenkt, dass der durchflusszytometerbasierte Assay die FITC-Intensität einzelner Zellen misst, können wir indirekt bestätigen, dass die Normalisierung der FITC-Werte mithilfe von OD die Unterschiede in der Zellzahl korrigiert.

Quantifizierung der Nanopartikelaufnahme durch Jurkat-Zellen für biologische Replikate. Die Streudiagramme zeigen drei biologische Replikate von Jurkat-Zellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von PSNP50 behandelt wurden. (A) FITC-Intensität, gemessen mit einem Plattenlesegerät, (B) optische Dichte, gemessen bei 600 nm mit einem Plattenlesegerät, (C) normalisierte FITC-Intensität durch die optische Dichte und (D) FITC-Intensität, gemessen mit einem Durchflusszytometer.

Anschließend untersuchten wir die Aufnahmekinetik von Jurkat-Zellen. Sie zeigten eine sofortige Aufnahme von PSNPs bei Exposition gegenüber Nanopartikeln. Die normalisierte FITC-Intensität von Zellen, die 2 Stunden lang Nanopartikeln ausgesetzt waren, betrug 70 % der Intensität, die bei Zellen gemessen wurde, die 24 Stunden lang behandelt wurden (ergänzende Daten, Abb. S9). In unserer früheren Arbeit haben wir in ähnlicher Weise beobachtet, dass THP-1-Zellen, ein Monozyten in Suspensionskultur, eine sofortige Aufnahme von Silica-Nanopartikeln zeigten, während Zellen vom adhärenten Typ – A549, HCC827 und HaCaT – einen stetigen linearen Anstieg der Nanopartikel-Aufnahme zeigten 24h32. Auch über eine ähnliche sofortige Aufnahme von Polyisopren-Nanopartikeln durch Jurkat-Zellen wurde bereits früher berichtet37.

Um den Assay weiter zu validieren, wurden drei unabhängige Versuchsreihen an verschiedenen Tagen durchgeführt und verglichen. Obwohl wir für jeden Assay das gleiche Protokoll befolgten, unterschieden sich die FITC-Messungen in einem der Experimente (Experiment 1) von den anderen, wie in Abb. 4A dargestellt. Die Messdaten können aufgrund verschiedener Faktoren schwanken, z. B. aufgrund von Unterschieden in der Zellzahl, die durch Unterschiede in der Proliferation entsprechend der Durchgangszahlen oder der anfänglichen Zellaussaatdichte verursacht werden, sowie aufgrund von Unterschieden im Zellverlust während der Zellernte und dem Waschen. Wenn die Schwankungen auf Unterschiede in der Zellzahl zurückzuführen sind, können sie durch Normalisierung der FITC-Intensität auf OD korrigiert werden. Tatsächlich verbesserte die Normalisierung den Grad der Übereinstimmung zwischen Experimenten erheblich, wie in Abb. 4B dargestellt; Die CV-Änderung durch Normalisierung ist in Abb. S10 dargestellt.

Quantifizierung der Nanopartikelaufnahme durch Jurkat-Zellen in mehreren Experimenten. Die Streudiagramme zeigen drei verschiedene Versuchsreihen mit Jurkat-Zellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von PSNP50 behandelt wurden. (A) Vor und (B) nach der Normalisierung der FITC-Intensität mit der Absorption bei 600 nm.

Die Korrelation zwischen Nanopartikelkonzentration und Fluoreszenzintensität war hoch, insbesondere im niedrigen Konzentrationsbereich, wie in Abb. S11 dargestellt. Mithilfe der linearen Beziehung können wir die Mindestkonzentration von PSNP50 berechnen, die für die Quantifizierung der Aufnahme erforderlich ist. In unserem Versuchsaufbau konnten A549-Zellen, die mit nur 1 µg/ml PSNP50 behandelt wurden, basierend auf der Hintergrundfluoreszenzintensität der unbehandelten Negativkontrolle nachgewiesen werden.

Um die Vielseitigkeit des entwickelten Assays zu untersuchen, haben wir zwei weitere Zelltypen weiter getestet. Eine davon ist die adhärente Zelllinie A549, eine menschliche Lungenkarzinomzelle, und die andere ist eine zweite Suspensionszelllinie, RPMI8226, ein menschlicher B-Lymphozyten. Zunächst wurde für beide Zelllinien die Korrelation zwischen Zellzahl und OD untersucht. Die Ergebnisse sind in Abb. 5A und B dargestellt. Für die A549-Zellen wurden zwei separate Experimente mit Zellzahlen im Bereich von 0,42 bis 7,4 × 105 Zellen pro Vertiefung durchgeführt Eine 96-Well-Platte zeigte eine gute Korrelation zwischen Zellzahl und OD. Ebenso zeigten die RPMI8226-Zellen im Bereich von 0,4 bis 7,5 × 105 Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte ebenfalls eine gute lineare Korrelation zwischen Zellzahl und OD. Alle drei Zelllinien zeigten eine lineare Beziehung zwischen Zellzahl und OD, jedoch mit unterschiedlichen Koeffizienten (dh Steigungen). Der Beitrag der Zellen zur Signalintensität von OD war bei A549 am höchsten und bei Jurkat-Zellen am niedrigsten (ergänzende Daten, Abb. S12 (A)). Die optische Dichte von Zellen hängt von ihrer Größe und Komplexität ab. Wir haben uns daher die von einem Durchflusszytometer erhaltenen Streuparameter angesehen, nämlich die Vorwärtsstreuung (FSC) und die Seitenstreuung (SSC), die die Größe bzw. die Komplexität eines Objekts widerspiegeln. Wie in den ergänzenden Daten Abb. S12(B) und S12(C) gezeigt, waren beide Parameter bei A549 am höchsten und bei Jurkat am niedrigsten, und diese Ergebnisse erklären die Variation in der Steigung der Korrelation zwischen Zellzahl und OD zwischen den Zelllinien .

Streudiagramme, die die Korrelation zwischen Zellzahl und optischer Dichte zeigen, gemessen bei 600 nm für (A) A549- und (B) RPMI8226-Zellen. FITC-PSNP50-Aufnahmeergebnisse verschiedener Versuchsreihen mit (C) A549- und (D) RPMI8226-Zellen.

Anschließend untersuchten wir, ob die Nanopartikelbehandlung die Zellmorphologie und Proliferation der A549- und RPMI8226-Zellen beeinflusst, wie wir es bei den Jurkat-Zellen beobachtet hatten. Bezüglich der Zellmorphologie kam es bei keiner Zelllinie bei allen behandelten Nanopartikeln zu einer merklichen Veränderung (Abb. S13(A) und S13(B)). Bei den A549-Zellen wurde die Zellproliferation mittels Live-Bildgebung und anschließender Zellzahlanalyse gemessen. Mit Nanopartikeln behandelte Zellen zeigten unabhängig von der Nanopartikelkonzentration ein ähnliches Wachstumsmuster, was zeigt, dass das Vorhandensein von Nanopartikeln bis zu 100 µM keinen Einfluss auf die Zellproliferation hatte (Abb. S13(C)). Eine längere Kultur über 72 Stunden zeigte auch keine signifikante, von der Nanopartikelkonzentration abhängige Veränderung des Zellwachstums (Abb. S13 (D)). Bei den RPMI8226-Zellen wurde die Zellzahl, die mit einem Durchflusszytometer unter Verwendung von Zählperlen genau geschätzt wurde, unabhängig von der Konzentration der behandelten Nanopartikel auf einem konstanten Niveau gehalten (Abb. S13(E)).

Anschließend wurde die Nanopartikelaufnahme für beide Zelllinien mithilfe des entwickelten Assays analysiert. Wir konnten in beiden Zelllinien ähnliche konzentrationsabhängige Aufnahmeergebnisse der Nanopartikel beobachten, ähnlich denen, die in Jurkat-Zellen beobachtet wurden. RPMI8226 zeigte ähnlichere Ergebnisse wie Jurkat-Zellen und zeigte einen eher linearen Anstieg der FITC-Intensität bis zu 25 µg/ml, gefolgt von einem leicht verzögerten Anstieg bei höheren Konzentrationen, wohingegen A549-Zellen einen ziemlich linearen und konsistenten Anstieg der FITC-Intensität mit zunehmender Konzentration zeigten behandelte Nanopartikel, wie in Abb. 5C und D dargestellt. Wir konnten erneut bestätigen, dass die Normalisierung mithilfe der OD die Abweichung zwischen biologischen Replikaten der Zellen verringerte, indem wir Streudiagramme vor und nach der Normalisierung verglichen und auch anhand der Durchflusszytometerergebnisse, wie in dargestellt Zusatzdaten Abb. S14 und S15.

Bei Proben, die mit niedrigeren Nanopartikelkonzentrationen behandelt wurden, verbesserte die Normalisierung durch OD nicht unbedingt die CV-Werte. Da jede Vertiefung der 96-Well-Platte eine ähnliche Anzahl an Zellen enthält, bleibt die OD jeder Vertiefung (dh der Nenner für die Normalisierung) unabhängig von der behandelten Nanopartikelkonzentration konstant, wohingegen die Fluoreszenzintensität stark von der Konzentration abhängt. Bei Proben, die mit 5 µg/ml Nanopartikeln behandelt wurden, ist die Fluoreszenzintensität sehr niedrig und liegt nahe am Hintergrundniveau, was zu Schwankungen der normalisierten Werte führen kann. Für Proben mit einer FITC-Intensität über dem Hintergrundwert – in unserem Test Zellen, die mit 10 µg/ml oder höheren Konzentrationen an Nanopartikeln behandelt wurden – wurde jedoch bestätigt, dass der CV deutlich gesenkt und die Zuverlässigkeit der Messung verbessert werden konnte .

Schließlich haben wir den Fall in Betracht gezogen, eine einzelne 96-Well-Platte für den gesamten Assay zu verwenden, also die Ernte- und Transferschritte zu eliminieren. Wenn wir die anhaftenden Zellen unverändert ohne Übertragung für die Fluoreszenzmessung verwenden, werden Messschwankungen, die durch die Übertragung der Zelllösung von der 6-Well-Platte auf die 96-Well-Platte und das Waschen der Zellen durch Zentrifugation verursacht werden, eliminiert. Solange das Waschen der anhaftenden Zellen in den Vertiefungen die Nanopartikel wirksam entfernt und das Fluoreszenzsignal hoch genug ist, um den Grad der Aufnahme zu quantifizieren, gehen wir davon aus, dass die Messergebnisse dieses Formats ebenfalls zuverlässig sein können. Hierzu haben wir untersucht, ob die Messergebnisse des entwickelten Assays mit dem Fall vergleichbar sind, in dem sowohl Zellkultur als auch Fluoreszenzmessung in derselben Wellplatte für adhärente Zellen durchgeführt werden.

In diesem Format wurden die adhärenten A549-Zellen zunächst in einer 96-Well-Platte kultiviert, mit Nanopartikeln behandelt und anschließend sorgfältig gewaschen. Die Fluoreszenz wurde mit einem Plattenlesegerät gemessen. Wir konnten einen von der Nanopartikeldosis abhängigen linearen Anstieg der FITC-Intensität behandelter A549-Zellen beobachten, ein Trend, der den Ergebnissen sehr ähnlich ist, die bei A549-Zellen in Suspension beobachtet wurden (Abb. S16(A)). Bei diesem Format gab es jedoch technische Schwierigkeiten beim Waschschritt zur Entfernung restlicher Nanopartikel. Wir müssen die Zellen vorsichtig durch Pipettieren waschen, um eine Zellablösung zu verhindern. Doch selbst bei sorgfältigem Waschen begannen einige Zellen nach dem zweiten Waschen abzufallen. Die Fluoreszenzintensität nahm nach dem zweiten Waschen ab (Abb. S16(B)), aber es war schwierig, die Ursache für die Entfernung restlicher Nanopartikel, die unvermeidbare Ablösung einer kleinen Anzahl von Zellen während des Waschens und den Nanopartikelausfluss aus zu bestimmen Zellen während des Waschens, da aufgrund des Zellverlustes kein weiteres Waschen durchgeführt werden konnte. Obwohl wir zeigen konnten, dass der Nanopartikel-Aufnahmetest für adhärente Zellen mit einer einzigen 96-Well-Platte sowohl für die Zellkultur als auch für die Fluoreszenzmessung durchgeführt werden kann, sind für einen zuverlässigen Test weitere Optimierungen und Validierungen erforderlich.

In dieser Arbeit haben wir einen auf Mikrotiterplatten basierenden Assay zur Aufnahme fluoreszierend markierter Nanopartikel entwickelt, der sowohl für Suspensions- als auch für adhärente Zellen verwendet werden kann, und ihn erfolgreich auf drei Säugetierzelllinien angewendet. Während der Entwicklung haben wir mögliche Faktoren berücksichtigt, die die Anzeige beeinflussen könnten, und nach Möglichkeiten gesucht, die Zuverlässigkeit des Tests zu erhöhen. Dadurch wurde die Fluoreszenzintensität durch die optische Dichte normalisiert, die weitgehend der Zellzahl entspricht, was die Übereinstimmung zwischen den biologischen und technischen Replikaten und auch zwischen mehreren Versuchsreihen, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden, verbesserte. In Anbetracht der Tatsache, dass die experimentellen Ergebnisse abhängig von Passagen oder Kulturbedingungen für zellbasierte Tests stark vom Zellstatus beeinflusst werden, ist die Normalisierung der Messwerte anhand der optischen Dichte, die in direktem Zusammenhang mit der Zellzahl steht, ein vorteilhafter Schritt für den entwickelten Test. Dies ist besonders nützlich, da beim Ablesen der Fluoreszenz ohne zusätzliche experimentelle Verfahren nur eine zusätzliche Ablesung der Absorption erforderlich ist. Zusätzlich zur Normalisierung wurden die Anzahl der Waschvorgänge und die Probenhandhabungstemperatur optimiert, um zuverlässige Ergebnisse zu liefern. Weitere Optimierungen, wie die Verwendung von Phenolrot-freiem Zellkulturmedium, um die nachteiligen Auswirkungen einer längeren Aufbewahrung der Zellen in 1 × PBS zu reduzieren, und eine ausgefeilte Kalibrierung der optischen Dichte33 können die Zuverlässigkeit des Assays verbessern. Unser Assay misst integrierte Signale von einem Ensemble von Zellen, anstatt einzelne Zellen zu untersuchen, und kann daher im Gegensatz zu anderen Techniken wie der Mikroskopie keine detaillierten Informationen über die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln liefern. Stattdessen bietet es den Vorteil, dass die Aufnahme von Nanopartikeln mehrerer Proben unter verschiedenen Bedingungen schnell und gleichzeitig mit einem leicht zugänglichen Aufbau aus routinemäßiger Zellkultur und Plattenablesung bewertet werden kann. Daher kann es als nützliches Werkzeug zur Ergänzung bestehender anspruchsvoller und präziser Nanopartikel-Aufnahmetests dienen.

Jurkat-, A549- und RPMI8226-Zellen wurden in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 200 Einheiten pro ml Penicillin und 200 Einheiten pro ml Streptomycin, gehalten und bei 37 °C in einem befeuchteten Raum inkubiert % CO2-Atmosphäre. Alle Zelllinien wurden von ATCC (American Type Culture Collection) bezogen. Phasenkontrastbilder der Zellen wurden mit einem Umkehrmikroskop (Olympus IX71) aufgenommen. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Kulturmaterialien von Thermo Fisher Scientific bezogen. Der Zellzähl- und Lebensfähigkeitstest wurde mit einem Countess II FL unter Verwendung der Trypanblau-Ausschlussmethode (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt.

Für die Suspensionszellen Jurkat und RPMI8226 wurden Zellen gehalten, die 1–2 × 106 Zellen/ml nicht überstiegen und eine Ansäuerung des Mediums vermieden wurden, und vor der Nanopartikelbehandlung wurde eine angemessene Anzahl von Zellen vorbereitet. Für die adhärenten Zellen A549 wurden die Zellen in Platten mit 6 Vertiefungen in einer Dichte von 2–3 × 105 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Am folgenden Tag wurde das Kulturmedium durch frisches Medium ersetzt und für die Nanopartikelbehandlung verwendet. Für ein 96-Well-Plattenexperiment wurden A549-Zellen in einer Dichte von 6–8 × 104 Zellen pro Well in eine 96-Well-Platte ausgesät. Am folgenden Tag wurde das Kulturmedium durch frisches Medium ersetzt und für die Nanopartikelbehandlung verwendet.

Für die Suspensionszellen wurden 4–5 × 105 Zellen pro Vertiefung in eine Platte mit 6 Vertiefungen ausgesät und dann ein geeignetes Volumen von 10 × konzentrierten 50 nm großen grün gefärbten Polystyrol-Nanopartikeln (Fluoro-Max Dyed Green Aqueous Fluorescent Particle, Anregung und Emission) zugegeben Peaks von 468 und 508 nm, Thermo Fisher Scientific), hergestellt in Kulturmedium, wurde hinzugefügt und durch Pipettieren gemischt. Für die Adhäsionszellen wurde ein geeignetes Volumen von 10 × konzentrierten 50 nm großen grün gefärbten Polystyrol-Nanopartikeln, hergestellt in Kulturmedium, zugegeben und durch leichtes Rühren von Hand gemischt. Für einen Routinetest wurden die Zellen nach 24 Stunden geerntet und zweimal mit einer ausreichenden Menge 1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, um restliche Nanopartikel sowohl im Kulturmedium als auch auf den Zelloberflächen zu entfernen. Die Zellen aus jeder Vertiefung wurden in 0,6 ml 1 × PBS resuspendiert und vor weiteren Analysen bei 4 °C aufbewahrt. Für einen Kinetiktest wurden die Zellen nach 2, 4, 6 und 24 Stunden geerntet und für Analysen vorbereitet. Für das 96-Well-Plattenexperiment mit A549-Zellen wurden die Zellen zweimal vorsichtig mit 300 µL 1 × PBS gewaschen, um eine Zellablösung zu vermeiden, und dann wurden 180 µL 1 × PBS hinzugefügt.

Für den Waschtest wurden Jurkat-Zellen in einer 100-mm-Kulturschale mit einer Dichte von 3–4 × 106 Zellen pro 10 ml Kulturmedium mit 100 µg/ml Nanopartikeln vorbereitet. Nach 24 Stunden wurden die Zellen geerntet und unterschiedlich oft mit einem ausreichenden Volumen an 1 × PBS gewaschen und dann in 1 × PBS resuspendiert und vor weiteren Analysen bei 400 °C aufbewahrt.

Mit Nanopartikeln behandelte Zellen wurden zu je 180 µL in drei Vertiefungen einer schwarzwandigen 96-Well-Platte (Corning) aliquotiert. Die Messung wurde unmittelbar nach der Aliquotierung mit einem Synergy HTX-Mikroplattenlesegerät (BioTek) durchgeführt. Vor der Messung wurde die Platte 2 s lang geschüttelt. Die Fluoreszenz wurde von unten mit Anregungs- und Emissionspeaks von 485 und 528 nm gemessen. Die Absorption wurde von 400 bis 650 nm in 50-nm-Intervallen gemessen. Die Aufnahmeeinstellungen einschließlich der Verstärkung blieben für alle Experimente gleich.

Die Zellen wurden mit einem FACSVerse (BD Biosciences) analysiert. Für die Analyse der Nanopartikelaufnahme wurde die lebende Einzelzellpopulation nach Ausschluss von Zelltrümmern und Dubletts in einem Diagramm der Vorwärtsstreuung gegenüber der Seitenstreuung erfasst und das FITC-Histogramm für die Analyse verwendet. Für die Zellzählung wurden entweder TruCount-Röhrchen oder flüssige Zählperlen (BD Biosciences) verwendet. Für Ersteres wurden 300 µL verdünnte Zelllösung in die Röhrchen gegeben, und für Letzteres wurden 250 µL verdünnte Zelllösung und 50 µL Perlenlösung vor der Messung gemischt. Die Zellen wurden entsprechend verdünnt, um das Akquisitionsereignis nicht zu dominieren. Die Erfassungseinstellungen einschließlich der Spannung jedes Kanals blieben für alle Experimente gleich. Zur Analyse wurden die zählenden Kügelchen- und Nicht-Kügelchen-Populationen in einem Diagramm der Fluoreszenz (z. B. FITC oder PerCP-Cy5.5) gegenüber der seitlichen Streuung erfasst, und dann wurde die Zellpopulation der Nicht-Kügelchen-Population unter Ausschluss von Trümmern erfasst ein Diagramm der Vorwärtsstreuung gegenüber der Seitenstreuung. Alle Daten wurden mit FlowJo (Version 10.8, FlowJo LLC) analysiert.

A549-Zellen wurden in 35-mm-Schalen mit klarem Boden (ibidi) mit einer Dichte von 2 × 10 pro Vertiefung ausgesät und 72 Stunden lang mit einem automatisierten Lionheart FX-Mikroskop (Biotek) überwacht. Die Bilder wurden alle 2 Stunden aufgenommen. Pro Schale wurden Bilder aus 16 Sichtfeldern gesammelt und gemeinsam analysiert.

Die hydrodynamische Größe und das Zetapotential der Nanopartikel wurden mit einem Zetasizer Nano ZSP (Malvern Panalytical) bestimmt. Die Ergebnisse werden als Durchschnitt von drei Läufen angegeben. Bilder der Rastertransmissionselektronenmikroskopie (STEM) wurden mit einem ringförmigen STEM-Detektor (aSTEM) unter Verwendung der Rasterelektronenmikroskopie (ZEISS GeminiSEM 500) aufgenommen. Die Analyse des Partikeldurchmessers wurde mit ImageJ unter Verwendung des Schwellenwerts von Otsu durchgeführt. Es wurden nur unabhängig voneinander getrennte Nanopartikel ausgewählt und gemessen, insgesamt wurden 360 Nanopartikel für die Messung analysiert.

Der FI der Nanopartikel wurde mit einem selbstgebauten TIRF-Mikroskop gemessen. Ein 488-nm-Strahl wurde verwendet, um auf der Oberfläche immobilisierte Nanopartikel durch unspezifische Bindung anzuregen. Die Fluoreszenz der Proben wurde durch eine Objektivlinse (UPLSAPO 60XW, Olympus) gesammelt und mit einem elektronenvervielfachenden CCD (iXon Ultra 888, Andor Technology) abgebildet. Filmdateien (2–3 s lang) wurden mit 100 ms pro Bild aufgezeichnet. Der FI einzelner Partikel wurde mit IDL (ITT Visual Information Solution) und MATLAB (MathWorks) extrahiert und analysiert.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

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Diese Arbeit wurde vom Nano Material Technology Development Program (Nr. 2016M3A7B6908929) der National Research Foundation (NRF) und KRISS-GP2021-0003-09 des Korea Research Institute of Standards and Science vom Ministerium für Wissenschaft und IKT unterstützt.

Biometrology Group, Abteilung für chemische und biologische Metrologie, Korea Research Institute of Standards and Science, 267 Gajeong-Ro, Yuseong-Gu, Daejeon, 34113, Republik Korea

Hye Ji Shin & Ji Youn Lee

Nanosicherheitsteam, Safety Measurement Institute, Korea Research Institute of Standards and Science, 267 Gajeong-Ro, Yuseong-Gu, Daejeon, 34113, Republik Korea

Minjeong Kwak

Bioimaging-Team, Safety Measurement Institute, Korea Research Institute of Standards and Science, 267 Gajeong-Ro, Yuseong-Gu, Daejeon, 34113, Republik Korea

Sihwa Ja

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Idee und Studiendesign: JYL Datengenerierung und -analyse: HJS, MK, SJ und JYL Verfassen von Manuskripten: HJS, MK, SJ und JYL

Korrespondenz mit Ji Youn Lee.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Shin, HJ, Kwak, M., Joo, S. et al. Quantifizierung der Aufnahme fluoreszierender Nanopartikel in Säugetierzellen mithilfe eines Plattenlesegeräts. Sci Rep 12, 20146 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24480-3

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Eingegangen: 26. Mai 2022

Angenommen: 16. November 2022

Veröffentlicht: 23. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24480-3

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