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Jun 26, 2023

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Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 2934 (2023) Diesen Artikel zitieren 943 Zugriffe auf 3 Altmetric Metrics-Details Die tatsächliche Interaktion zwischen Signalarten in zellulären Prozessen ist häufig

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 2934 (2023) Diesen Artikel zitieren

943 Zugriffe

3 Altmetrisch

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Die tatsächliche Interaktion zwischen Signalspezies in zellulären Prozessen ist oft wichtiger als ihre Expressionsniveaus. Der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ist ein beliebtes Werkzeug zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen, da er sehr empfindlich auf Nähe im Bereich von 2–10 nm reagiert. Der spektrale Spillover-korrigierte quantitative (3-Würfel) FRET ist ein kostengünstiger und vielseitiger Ansatz, der in der Durchflusszytometrie und verschiedenen Modalitäten der Fluoreszenzmikroskopie angewendet werden kann, jedoch durch unterschiedliche Autofluoreszenzniveaus behindert werden kann. Hier haben wir eine pixelweise Autofluoreszenzkorrektur in mikroskopischen FRET-Messungen implementiert und dabei zellfreie Kalibrierungsstandards ohne Autofluoreszenz genutzt, die die korrekte Bestimmung aller spektralen Spillover-Faktoren ermöglichen. Wir präsentieren außerdem ein ImageJ/Fiji-Plugin zur interaktiven Analyse einzelner Bilder sowie zur automatischen Erstellung quantitativer FRET-Effizienzkarten aus großen Bildsätzen. Zur Validierung verwendeten wir Bead- und zellbasierte FRET-Modelle, die eine Reihe von Signal-Autofluoreszenz-Verhältnissen und FRET-Effizienzen abdeckten, und verglichen den Ansatz mit der herkömmlichen durchschnittlichen Autofluoreszenz-/Hintergrundkorrektur. Die pixelweise Autofluoreszenzkorrektur erwies sich hinsichtlich der Genauigkeit der Ergebnisse als überlegen, insbesondere bei Proben mit räumlich variierender Autofluoreszenz und niedrigem Verhältnis von Fluoreszenz zu Autofluoreszenz, wobei letzteres häufig bei physiologischen Expressionsniveaus der Fall ist.

Der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ist ein kollisionsfreier, strahlungsfreier Energietransfer zwischen einem fluoreszierenden Donorfarbstoff und einem spektral adäquaten Akzeptorfarbstoff, der aus praktischen Gründen häufig als fluoreszierend ausgewählt wird1. Seit den späten 1960er Jahren hat sich FRET nach und nach zu einem beliebten Werkzeug zur Bestimmung der Nähe zwischen Makromolekülen entwickelt. Die Effizienz der Energieübertragung (E) ist eine Funktion der umgekehrten sechsten Potenz des Abstands zwischen Donor- und Akzeptorfarbstoff, der sich im Bereich von 2–10 nm schnell ändert. Dieser Empfindlichkeitsbereich dient als Grundlage für die Ermittlung und den Vergleich von Wechselwirkungen auf molekularer Ebene, selbst in optischen Instrumenten, die ansonsten aufgrund der Beugung auf ein geringeres Auflösungsvermögen beschränkt sind2. Auch wenn die sich rasch verbessernden Superauflösungstechniken die Auflösungsgrenze immer weiter nach unten verschieben, bleibt noch viel Raum für FRET-Techniken3. Es gibt eine Vielzahl von Ansätzen zur Messung von FRET in der Mikroskopie4, von Einzelmolekülmessungen5,6 bis hin zu Ensemble-Ansätzen, von denen viele keine teure Instrumentierung erfordern und/oder die Probe nicht zerstören7,8,9. Dazu gehören ratiometrische Methoden, die sich am besten im immer größer werdenden Bereich fluoreszierender proteinbasierter Biosensoren mit bekannter Donor/Akzeptor-Stöchiometrie10 eignen, sowie quantitative Messmodalitäten, die eine kalibrierte FRET-Effizienz unabhängig von der Donor/Akzeptor-Stöchiometrie11 liefern. Von diesen stellt die Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung (FLIM) eine intrinsisch quantitative Methode dar, erfordert jedoch eine fortschrittliche Instrumentierung12,13, während der spektrale Spillover-korrigierte (oder Drei-Würfel-) FRET ein kostengünstiger und vielseitiger Ansatz ist, der in der Durchflusszytometrie und der konventionellen Methode angewendet werden kann Fluoreszenzmikroskopie. Im Gegensatz zur ebenfalls beliebten Akzeptor-Photobleichtechnik14,15 kann sie auch in Verbindung mit Zeitraffer- und 3D-Bildanalyse11,16 verwendet werden.

Die Hauptbeschränkung bei jeder Methode für FRET-Messungen ist das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR). SNR ist der erwartete Wert des Signals dividiert durch seine SD. Hier pflanzt sich das Rauschen aller gemessenen Fluoreszenzintensitäten, die in weiteren Berechnungen verwendet werden, in die FRET-Effizienz fort. Unter der Annahme einer Poisson-Verteilung der detektierten Photonen pro Pixel mit dem erwarteten Wert λ beträgt das SNR √λ, wenn das systematische Rauschen vernachlässigbar ist. Daher ist zu erwarten, dass niedrigere Intensitäten die Unsicherheit des ermittelten FRET E stärker erhöhen. Proben mit niedrigem SNR können für die FRET-Analyse geeigneter gemacht werden, indem die Quanteneffizienz und Photostabilität der Fluoreszenzfarbstoffe verbessert, eine effizientere Detektion17, die Optimierung der FRET-Farbstoffpaare18,19 und verbesserte mathematische und statistische Ansätze20,21,22 verwendet werden. 23. Die Verwendung der spektralen Spillover-korrigierten Methode ermöglicht im Allgemeinen Rückschlüsse auf bestehende molekulare Wechselwirkungen, wenn eine FRET-Effizienz von ~ 5 % oder mehr beobachtet wird.

Das erreichte SNR wird auch durch zelluläre Autofluoreszenz begrenzt. Da die Autofluoreszenz im roten Spektralbereich weniger ausgeprägt ist, sollten vorzugsweise rotverschobene Donor-Akzeptor-Farbstoffpaare verwendet werden, wie z. B. Alexa Fluor 546–Alexa Fluor 64724. Es stehen auch mehrere andere Methoden zur Verfügung, um den verzerrenden Effekt der Autofluoreszenz zu verringern. Das Überlaufen der Autofluoreszenz in die Markierungsfluoreszenz wurde sowohl in der Mikroskopie25 als auch in der Durchflusszytometrie korrigiert, was die Genauigkeit der FRET-E-Bestimmung26 erheblich verbesserte. Das Labor von Silas Leavesley hat den Ansatz durch die Einführung der spektralen Entmischung27 weiter verbessert und gezeigt, dass die Methode zur Bewertung unterteilter Signalmechanismen mithilfe der 3D-Spektralbildgebung28 anwendbar ist. In einem äußerst innovativen Ansatz haben Cardoso Dos Santos et al. haben Time-Gating auf die Fluoreszenzlebensdauer-Bildmikroskopie angewendet und Quantenpunkte mit fluoreszierenden Proteinen kombiniert, um FRET zu bewerten und gleichzeitig native Fluoreszenz auszuschließen29. Während Spektral- und Lebensdauerbildgebung immer mehr an Bedeutung gewinnen, ist es das konventionelle konfokale Mikroskop, zu dem heutzutage fast alle Biologen Zugang haben. Vor diesem Hintergrund haben wir uns zum Ziel gesetzt, unser bisheriges ImageJ/Fiji-Plugin (RiFRET16) zur Auswertung spektraler Spillover-korrigierter FRET-Messungen durch die Einführung der Option einer pixelweisen Autofluoreszenzkorrektur zu verbessern. Da die Messung des Instrumentenkalibrierungsfaktors α durch verschiedene unkontrollierbare Umstände in zellulären Systemen behindert wird und nur für fluoreszierende Proteinkonstrukte zuverlässig erreicht werden konnte30,31, haben wir zunächst zellfreie Standardobjektträger für seine genaue Bestimmung erstellt und validiert. Diese Standards ermöglichten auch die genaue Bestimmung spektraler Spillover-Faktoren, indem sie den Störeffekt der zellulären Autofluoreszenz verhinderten. Schließlich haben wir mithilfe einer Reihe von Modellen mit unterschiedlichen Niveaus an Fluoreszenzsignalen und Autofluoreszenz gezeigt, dass die Untersuchung von FRET an Zellen mit normalem Expressionsniveau der interessierenden Proteine ​​und mit räumlich variierenden Autofluoreszenzniveaus am meisten von der pixelweisen Autofluoreszenz profitiert Korrektur. Das für eine benutzerfreundliche Analyse dieser Messungen erstellte RiFRET v2 ImageJ-Plugin steht der Forschungsgemeinschaft sowohl über GitHub als auch über den Fiji-Updater zur Verfügung und ermöglicht auch die vollautomatische Analyse großer Datensätze.

Für eine pixelweise korrigierte FRET-Messung sollten vier Fluoreszenzkanäle gemessen werden: I0 ist die in einem Hilfskanal gemessene Autofluoreszenz, die in unserem Beispiel im Vergleich zum Donorkanal blauverschoben ist. Es sollte auch möglich sein, für diesen Zweck einen fernroten Kanal zu verwenden, wenn Donor und Akzeptor stärker blauverschoben sind, falls es nicht praktikabel ist, Anregung im nahen UV und blaue Emission zu verwenden (z. B. im Fall der Verwendung einer Kernfärbung in diesem Fall). Spektralbereich). I1 ist der Donorkanal, der spektral für den Donorfarbstoff geeignet sein sollte. I2 ist der Transferkanal mit Donor-Anregung und Akzeptor-Detektionsbereich. I3 ist der Akzeptorkanal mit für den Akzeptorfarbstoff geeigneter Anregung und Detektion. Durch diesen spektralen Aufbau eignet sich die Methode für FRET-Paare Alexa Fluor 488/546 und Alexa Fluor 546/647 oder andere Farbstoffpaare mit ähnlichen spektralen Eigenschaften. Der erste Schritt der Auswertung ist immer die Subtraktion des Instrumentenhintergrunds für jeden Kanal. Dies muss auf einem nicht fluoreszierenden Objektträger gemessen werden.

Die folgenden Gleichungen (1–4) beschreiben den Beitrag verschiedener Komponenten zu jedem Fluoreszenzkanal. AF ist die Autofluoreszenz in Kanal 0. ID und IA sind die Fluoreszenzintensität des ungelöschten Donors bzw. des Akzeptors in ihren eigenen Detektionskanälen. Die anderen Komponenten sind unten beschriebene Kalibrierungsfaktoren.

Der epsR (Gleichung 5) ist das Produkt der Verhältnisse der molaren Absorptionskoeffizienten der Donor- und Akzeptorfarbstoffe bei den jeweiligen Anregungswellenlängen zu ihren Absorptionskoeffizienten bei ihren eigenen Anregungswellenlängen. Für die meisten Farbstoffpaare ist dieser Wert vernachlässigbar klein.

S1, S3 und S5 werden anhand einer Probe bestimmt, die nur den Donorfarbstoff enthält, wie in den Gleichungen beschrieben. (6–8).

S2, S4 und S6 werden an einer reinen Akzeptorprobe bestimmt (Gleichungen 9–11).

B1, B2 und B3 werden an unmarkierten Zellproben (Nl) bestimmt (Gl. 12–14).

Der Alpha-Parameter korrigiert den Unterschied in der Quanteneffizienz QA und QD und der Nachweiseffizienz ηA und ηD des Donors bzw. des Akzeptors und kann an mit Donor und Akzeptor markierten Proben bestimmt werden (Gleichung 15). Wenn für diesen Zweck markierte Zellen verwendet werden, sollte das Verhältnis der Expressionsniveaus von Donor- und Akzeptormolekülen über die gemessenen Zellen hinweg konstant sein. Idealerweise wird das gleiche Epitop verwendet, einmal mit Spender- und einmal mit Akzeptor-markierten Antikörpern. \({I}_{2}^{D}\) und \({I}_{3}^{A}\) sind an diesen Proben zu messen und über mindestens 5–10 Bilder zu mitteln. LD und LA sind die mittlere Anzahl von Farbstoffmolekülen, die an den Donor- und den Akzeptor-konjugierten Antikörper gebunden sind, BD und BA sind die mittlere Anzahl von Rezeptoren pro Zelle, die durch den Donor- und den Akzeptor-konjugierten Antikörper markiert sind, und \({\varepsilon }_ {D}\) und \({\varepsilon }_{A}\) sind die molaren Absorptionskoeffizienten der Donor- und Akzeptorfarbstoffe bei der Wellenlänge der Donoranregung.

Alpha kann auch mithilfe von Standardobjektträgern bestimmt werden, die mit den markierten Antikörpern hergestellt wurden. In diesem Fall sind BD und BA die molare Konzentration der mit Donor und Akzeptor konjugierten Antikörper.

Die FRET-Effizienz wird berechnet als:

Wo

Anhand dieses FRET-Effizienzwerts können auch die tatsächlichen Donor-, Akzeptor- und Autofluoreszenzwerte berechnet werden:

Für die Berechnung von FRET ohne pixelweise Autofluoreszenzkorrektur können dieselben Gleichungen verwendet werden, aber die Faktoren S5, S6 und B nehmen einen Wert von 0 an. Wenn keine Autofluoreszenzkorrektur durchgeführt wird, wird in jedem Bild und Kanal nur der Instrumentenhintergrund subtrahiert (IBG-korrigierte Auswertung). Die klassische Möglichkeit ist jedoch die Korrektur mit durchschnittlicher Autofluoreszenz (AVG-korrigierte Auswertung). Für diesen Ansatz muss die durchschnittliche Autofluoreszenz für die Kanäle I1, I2 und I3 an unmarkierten Proben mit denselben Geräteeinstellungen gemessen werden. Diese Werte (nach Korrektur des Instrumentenhintergrunds) werden als Konstanten von den jeweiligen I-Werten subtrahiert, anstatt \(AF\cdot {B}_{1}\), \(AF\cdot {B}_{2}\) zu verwenden. und \(AF\cdot {B}_{3}\) in den Gleichungen. (2–4). Gleichung (1) wird nicht verwendet und die Berechnung der FRET-Effizienz wird vereinfacht

Um den Autofluoreszenz-Korrekturalgorithmus zu testen, haben wir zunächst die Autofluoreszenzspektren von A172- und SKBR3-Zellen sowohl bei Befestigung an einer Glasoberfläche als auch in Suspension bestimmt. Die Spektren der Zelllinien weisen in den meisten sichtbaren Spektren nur geringe Unterschiede auf (Abb. 1a). Die Behandlung mit Trypsin veränderte die Autofluoreszenzeigenschaften nicht wesentlich (ergänzende Abbildung 1a). Die spektrale Homogenität der Autofluoreszenz in den Zelllinien legt nahe, dass es möglich ist, einen zusätzlichen Autofluoreszenzkanal für die pixelweise Autofluoreszenzkorrektur (PBP AF) des Signals in anderen Fluoreszenzkanälen anzuwenden, und dieser Kanal kann Anregungs- und Emissionswellenlängen nutzen /Wellenlängenbereiche, die sich deutlich von denen unterscheiden, die für die FRET E-Berechnung verwendet werden. Dies würde eine Verbesserung gegenüber dem früheren Ansatz der Durchflusszytometrie26 darstellen, bei dem die Anregung der Autofluoreszenz-, Donor- und Transferkanäle bei derselben Wellenlänge erfolgte. Wir haben auch die subzelluläre Verteilung der Autofluoreszenz untersucht (Abb. 1b), die eine hohe räumliche Inhomogenität der Emissionsintensität zeigte. Im Gegensatz zum hohen Variationskoeffizienten und der bimodalen Intensitätsverteilung in jedem Fluoreszenzkanal war die pixelweise Verteilung der Autofluoreszenz-Korrekturfaktoren, die durch Division der Donor-, Akzeptor- oder Transferbilder durch das Autofluoreszenz-Referenzbild erzeugt wurde, monomodal, nahezu gaußförmig und zeigte a Variationskoeffizient weniger als die Hälfte der Originalbilder (Ergänzende Abbildung 1b).

Charakterisierung der zellulären Autofluoreszenz und verschiedener Methoden zur Autofluoreszenzkorrektur. (a) Autofluoreszenz-Emissionsspektren von A172- und SKBR-3-Zellen, gemessen mit einem Spektraldetektor bei 488; Anregung bei 543 und 633 nm. Die typischen Emissionskanäle einer FRET-Messung werden als farbige Bänder dargestellt. (b) Autofluoreszenzintensitätsverteilung einer SKBR-3- und einer A172-Zelle. (c–e) Autofluoreszenzbeitrag zu den Donor-, Transfer- und Akzeptorkanälen einer typischen FRET-Messung vor der Korrektur, nach der Korrektur mit durchschnittlicher Autofluoreszenz und nach der Pixel-für-Pixel-Korrektur, auch anhand nicht markierter Zellen, die auf einem Deckglas gezüchtet wurden, demonstriert als in Suspension montierte Zellen nach Trypsinisierung. Durchschnittliche Emissionsintensitäten von 6 unabhängigen Proben in willkürlichen Einheiten als Violindiagramme (c-Donorkanal, d-Transferkanal, e-Akzeptorkanal). (f) Verhältnis der Standardabweichungen der pixelweise korrigierten zu den durchschnittlich korrigierten Autofluoreszenzverteilungen aus den Daten in den Panels (c–e).

Um zu zeigen, wie effektiv diese AF-Korrekturfaktoren bei der PBP-AF-Korrektur sind und welche Vorteile ihre Verwendung gegenüber der durchschnittlichen Autofluoreszenzsubtraktion mit sich bringen kann, haben wir zunächst nicht markierte Proben in den Fluoreszenzkanälen getestet und verglichen, die typischerweise bei 3-Würfel-FRET-Messungen verwendet werden (Abb. 1c). -F). Die perfekte Autofluoreszenzkorrektur einer nicht markierten Probe würde zu einer mittleren Intensität von Null mit einer kleinen Standardabweichung in jedem Kanal führen. Wie erwartet lag der Durchschnitt der integrierten Zellintensitäten bei beiden Korrekturen in allen drei FRET-Kanälen (Donor, Transfer und Akzeptor, Abb. 1c – e) nahe bei 0, was darauf hindeutet, dass beide Methoden im Durchschnitt den Zellhintergrund entfernen Fluoreszenz gut. Die Diagramme zeigen jedoch auch, dass der durchschnittliche Korrekturansatz zu einer größeren Streuung der korrigierten Fluoreszenzwerte von Zelle zu Zelle führt. Während diese Korrektur im Durchschnitt also gut funktioniert, werden viele einzelne Zellen nicht richtig korrigiert. Dies wird durch die Berechnung des Verhältnisses der SDs für PBP AF zur durchschnittlichen Korrektur gestützt (Abb. 1f), die eine Verbesserung um 50–60 % im Fall von A172-Zellen und um 20–40 % im Fall von SKBR3-Zellen zeigt, die Differenz Dies ist auf die niedrigeren Autofluoreszenzwerte (und deren geringere absolute Divergenz) in letzterem zurückzuführen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die PBP-AF-Korrektur die erwarteten, korrekten Durchschnittswerte liefert und gleichzeitig die Genauigkeit der Bestimmung für jede einzelne Zelle erheblich verbessert, wodurch die Stichprobenvarianz verringert wird. Es wird erwartet, dass dies wiederum die Varianz abgeleiteter Parameter wie FRET E verringert, indem der von mehreren Bildern in sie übertragene Fehler verringert wird. Es wird erwartet, dass auf subzellulärer Ebene ähnliche Verbesserungen erzielt werden können, wie später anhand biologisch relevanter FRET-Proben gezeigt wird.

Bevor jedoch mit dem Testen markierter Proben begonnen werden konnte, musste ein seit langem bestehendes Rätsel gelöst werden. In einem intensitätsbasierten FRET-Experiment müssen mehrere Korrekturfaktoren bestimmt werden: spektrale Spillover-Faktoren (S-Faktoren, Gleichungen 6–11) und der Alpha-Kalibrierungsfaktor (Gleichung 15). Jeder Korrekturfaktor sollte an einzelnen markierten Proben bestimmt werden. Da einzelne markierte Zellproben auch über eine eigene Autofluoreszenz verfügen, die von Zelle zu Zelle und von Pixel zu Pixel variiert, ist der relative Beitrag von spektralem Spillover und Autofluoreszenz zu jedem Pixel unbekannt, was eine korrekte Bestimmung der Fluoreszenzintensitäten ausschließt und daher von S-Faktoren. Daher haben wir ein Rezept zur Herstellung geeigneter zellfreier Kalibrierungsobjektträger ausgearbeitet (siehe Abschnitt „Materialien und Methoden“). Diese Objektträger können ohne Anzeichen einer Verschlechterung mindestens bis zu 6 Monate bei 4 °C gelagert werden. Auf der linken Seite von Abb. 2a,b präsentieren wir Beispielbilder dieser Proben. Wir haben die Leistung der Objektträger bei der Bestimmung des S- und Alpha-Faktors getestet. Die gemessenen Durchschnittsintensitäten wurden auf die photometrisch bestimmte Konzentration des für jeden Objektträger verwendeten Fluoreszenzfarbstoffs normiert (diese sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt). Sie zeigen eine hohe Homogenität über verschiedene Proben hinweg, was durch geringe Standardabweichungen und eine gute Linearität bei Verwendung eines breiten Spektrums an Anregungsleistungen angezeigt wird (Abb. 2a, b, rechte Tafel; ergänzende Abb. 2a). Die Emissionsspektren der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe wurden an Zellproben und auf Standardobjektträgern gemessen und waren identisch (ergänzende Abbildung 2b). Die Stabilität der Spektren und die Linearität der Emission legen nahe, dass die Objektträger zur Bestimmung der S-Faktoren und des Alphas geeignet sind. Die Zuverlässigkeit der Standardobjektträger wurde in einem Experiment weiter getestet, bei dem 49 Kombinationen von 14 Standardobjektträgern gemessen wurden und ein CV von 12,5 % erreicht wurde (Ergänzungstabelle 2). Als weiteren Beweis des Konzepts wurde der Alpha-Faktor mit BIIG2- und ab528-Antikörpern sowohl auf markierten A172-Zellen als auch unter Verwendung von Standardobjektträgern der markierten Antikörper bestimmt (Abb. 2c). Der auf Standardobjektträgern ermittelte Alpha-Faktor zeigte geringere Unterschiede zwischen den beiden Antikörpern und einen geringeren Messfehler. Man sollte auch berücksichtigen, dass Antikörper mit unterschiedlichen Farbstoff-/Protein-Verhältnissen (DOL) eine veränderte Bindungsaffinität aufweisen können, sodass der für die Antikörperlösung gemessene und zur Bestimmung von Alpha verwendete DOL möglicherweise nicht mit dem durchschnittlichen DOL der an Zellen gebundenen Antikörper übereinstimmt32. Dieses potenzielle Artefakt kann auch mithilfe der auf Antikörpern basierenden Standardobjektträger vermieden werden. Insgesamt sind diese Objektträger ein einfaches und kostengünstiges Mittel zur Bestimmung von Korrekturfaktoren für FRET-Messungen, mit dem zusätzlichen Vorteil, dass der billigste oder am leichtesten verfügbare Antikörper verwendet werden kann.

Standardobjektträger zur Bestimmung der Gerätekalibrierung (α) und der spektralen Spillover-Faktoren (S). (a,c) Bilder von Alexa Fluor 546- und 647-konjugiertem Trastuzumab-Film mit pixelweisen Intensitätsverteilungen als Einschübe. (b,d) Durchschnittliche Intensitäten von 3 verschiedenen Antikörpern, die an Alexa Fluor 546 oder Alexa Fluor 647 konjugiert sind, aufgetragen gegen 543-nm-Anregungslaserleistungen, normalisiert auf die Farbstoffkonzentration. Fehlerbalken stellen ± SD von n = 5 Bildern dar. (c) α-Kalibrierungsfaktor, bestimmt auf A172-Zellen und auf Standardobjektträgern unter Verwendung von zwei verschiedenen Antikörpern. Fehlerbalken sind ± SD aus n = 6 Bildern.

Um zu testen, ob und unter welchen Bedingungen die PBP-AF-Korrektur die FRET-Messungen im Vergleich zur durchschnittlichen Autofluoreszenzkorrektur verbessert, wurde ein Testsystem aufgebaut. In diesem System wurde ein nicht markierter Primärantikörper und ein sekundärer Markierungsantikörper verwendet, der unterschiedliche Verhältnisse von Donor- und Akzeptor-konjugierten Sekundärantikörpern mischt. Auf diese Weise können Proteinkomplexe mit FRET-Effizienz von niedrigen bis sehr hohen Werten konstruiert werden (Abb. 3a). Die primären Antikörper waren entweder an mit Protein G beschichtete Perlen, A172-Zellen oder SKBR3-Zellen gebunden. Protein-G-Kügelchen verfügen neben einer geringen Autofluoreszenz über eine hohe Dichte an Antikörperbindungsstellen und können sowohl Trastuzumab-Antikörper (menschlich) als auch ab528-Antikörper (Maus) binden. SKBR3-Zellen exprimieren eine hohe Menge an HER2 (~ 800.000 pro Zelle, gebunden durch Trastuzumab) und weisen eine mäßige Autofluoreszenz auf. A172-Zellen haben eine geringe Expression von EGFR (~ 80.000 pro Zelle, gebunden durch ab528) und die höchste Autofluoreszenz aller in diesem Versuchsaufbau verwendeten Ziele. Auf diese Weise können alle Kombinationen von hohem und niedrigem FRET E mit hoher und niedriger Autofluoreszenz sowie hohen und niedrigen Intensitäten beurteilt werden (Abb. 3b). Diese Proben können sowohl mit einem Durchflusszytometer als auch unter einem Mikroskop gemessen werden, wodurch die Leistung der beiden Ansätze verglichen werden kann. Zum Testen biologisch relevanter FRET-Paare wurde die A172-Zelllinie verwendet, die EGFR und die Integrine α5 (ITGA5) und β1 (ITGB1) exprimiert. Hier führt die funktionelle Wechselwirkung von EGFR mit einer der beiden Integrin-Untereinheiten 33, 34 zu unterschiedlichen Akzeptor/Donor-Verhältnissen und unterschiedlichen FRET E-Werten (Abb. 3c, d). Zur FRET-Positivkontrolle wurde der mit dem Spender konjugierte Primärantikörper mit dem entsprechenden Sekundärantikörper markiert, der mit dem Akzeptorfarbstoff konjugiert war (Abb. 3d). Die Akzeptor/Donor-Verhältnisse waren bei allen drei FRET-Positivkontrollproben sehr ähnlich (ergänzende Abbildung 3).

Modellsysteme zum Testen pixelweiser autofluoreszenzkorrigierter FRET-Messungen. (a) Schematische Darstellung der Molekülkomplexe, die einen breiten Bereich des Akzeptor-Donor-Farbstoffverhältnisses in den verwendeten FRET-Modellsystemen abdecken. (b) Relative Menge der molekularen FRET-Komplexe (aus Panel a) auf proteinbeschichteten Perlen und auf SKBR-3- und A172-Zellen und ihre Beziehung zur Autofluoreszenzintensität. (c) Relative Expressionsniveaus von Zelloberflächenproteinen auf A172-Zellen. EGFR – EGF-Rezeptor, ITGA5 – Integrin α5, ITGB1: Integrin β1. Fehlerbalken stellen ± SD dar, n = 6 Bilder, mindestens 30 Zellen. (d) Schematische Darstellung biologisch relevanter Molekülkomplexe und der gemessenen Akzeptor-Donor-Farbstoffverhältnisse zwischen ihnen.

Diese FRET-Proben auf Perlen und Zellen wurden sowohl mit Durchflusszytometrie als auch mit Mikroskopie gemessen. Die erhaltenen Daten wurden sowohl mit AVG- als auch mit PBP-Autofluoreszenzkorrektur ausgewertet. Die AVG-korrigierte FRET-Effizienz wurde vom PBP-korrigierten Wert für jede Zelle oder jedes Kügelchen in jeder Probe abgezogen, und der Probenmittelwert und die Standardabweichung der Unterschiede wurden gegen das Verhältnis von mit Akzeptor-Farbstoff konjugierten zu Donor-Farbstoff-konjugierten Sekundärantikörpern aufgetragen, an die gebunden wurde die primären Ziele. Der Unterschied zwischen der AVG- und der PBP-Korrekturmethode war vernachlässigbar, mit Ausnahme der Probe mit hoher Autofluoreszenz/niedriger Intensität (ab528 auf A172-Zellen, Abb. 4a). Dies war besonders deutlich im Fall der mikroskopbasierten Messung, bei der der Unterschied der FRET-Effizienz etwa 0,1 betrug, mit einer stark zunehmenden Tendenz bei den niedrigeren Akzeptor-Donor-Verhältnissen (Abb. 4a, rechtes Feld). Beim Vergleich der Diagramme des tatsächlichen FRET E-Verhältnisses mit dem Akzeptor-zu-Donor-Verhältnis (Abb. 4b) entsprechen zellbasierte Proben mit niedrigem Gesamtsignal der FRET-Effizienz in der Durchflusszytometrie und der PBP-korrigierten FRET-Mikroskopie, und diese stimmen sowohl mit PBP als auch mit AVG-korrigiertem überein FRET-Mikroskopiedaten von Proben auf Perlenbasis mit hoher Intensität. Nur die mithilfe der AVG-Korrektur ausgewerteten Zellmikroskopiedaten niedriger Intensität weichen voneinander ab. Diese Abweichung von den angenommenen tatsächlichen Werten ist wahrscheinlich auf das geringere Signal pro Pixel zurückzuführen. Während bei der AVG-Korrektur zwangsläufig jedes Pixel über- oder unterkorrigiert wird, ist dieser schädliche Effekt bei niedrigeren Signal-Rausch-Verhältnissen am deutlichsten und der Fehler pflanzt sich offensichtlich in der Verteilung der FRET-Effizienz fort. Die Verwendung der PBP-AF-Korrektur verbessert nicht das tatsächliche SNR, beseitigt aber zumindest den zusätzlichen Fehler, der durch die Korrektur räumlich ungleichmäßiger Autofluoreszenz mit einer globalen Konstante entsteht, wie in Abb. 1c, d gezeigt. Insgesamt sind die Proben, die durch die AVG-Korrektur am empfindlichsten auf Verzerrungen reagieren, diejenigen mit einem niedrigen Verhältnis von Markierungssignal zu Autofluoreszenz, wie für jeden gemessenen Fluoreszenzkanal sowohl durch Durchflusszytometrie als auch durch Mikroskopie in Abb. 4c gezeigt wird. In unserem Fall wurden die niedrigsten Verhältnisse bei EGFR-verankertem ab528, das die Mischung aus Donor- und Akzeptor-markierten Sekundärantikörpern bindet, auf A172-Zellen gemessen. Man würde daher erwarten, dass im Falle der Verwendung direkter Immunfluoreszenz zur Messung des FRET zwischen EGFR und anderen molekularen Spezies auf der Oberfläche dieser Zellen bei Verwendung der AVG-Korrektur eine noch größere Abweichung von den tatsächlichen Werten auftreten würde.

FRET gemessen an Perlen und Zellsuspensionen mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie. (a) Unterschiede der durchschnittlichen und pixelweisen Autofluoreszenzkorrektur, gemessen mit Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie am Kontrollprobensatz. Nach dem Gating blieben für jeden geplotteten Punkt mindestens 1700 Zellen/5000 Pixel übrig. Fehlerbalken sind ± SD. (b) FRET-Effizienzen, gemessen mit Spender auf dem ab528-Antikörper, aufgetragen gegen das Verhältnis von akzeptormarkiertem Antikörper. (c) Fluoreszenzsignale im Verhältnis zur Autofluoreszenz, gemessen mit Durchflusszytometrie und Mikroskopie in allen FRET-bezogenen Kanälen. Die Daten werden in Geigendiagrammen angezeigt.

Daher haben wir als nächstes die FRET-Effizienz zwischen EGFR und ITGA5 oder ITGB1 an A172-Zellen gemessen. Da diese beiden Integrine in einem fünffachen bzw. achtfachen Verhältnis zu EGFR exprimiert werden (Abb. 3c), haben wir FRET einmal mit dem Spender und dann mit der Akzeptormarkierung auf EGFR gemessen, um den Einfluss des Akzeptor/Donor-Verhältnisses zu beurteilen. Bei diesen Proben folgten die FRET-Effizienzen (Abb. 5a, linkes Feld) den Trends der gemessenen Akzeptor/Donor-Verhältnisse (Abb. 3d) und ergaben niedrigere FRET E-Werte für die Fälle, in denen EGFR mit dem Akzeptor markiert war. Die zwischen EGFR und ITGA5 gemessenen FRET-Effizienzen waren im Allgemeinen niedrig, mit nur geringen Unterschieden zwischen den nicht korrigierten und den PBP-korrigierten Werten. Die AVG-Korrektur ergab einen negativen durchschnittlichen FRET E, wenn ITGA5 der Spender war, ein starker Hinweis darauf, dass die AVG-Autofluoreszenzkorrekturmethode starke Artefakte erzeugen kann, insbesondere wenn FRET E niedrig ist. Die zwischen EGFR und ITGB1 gemessenen FRET-Effizienzen waren im Allgemeinen höher, was darauf hindeutet, dass die sterische Positionierung des Antikörpers, der ITGB1 markiert, für den FRET-Prozess geeigneter ist als die von ITGA5, auch wenn diese beiden Integrine voraussichtlich Heterodimere bilden und daher möglicherweise miteinander interagieren könnten EGFR genauso gut. Die AVG-Korrektur ergab eine sehr hohe FRET-Effizienz, wenn ITGB1 der Akzeptor war, und 0, wenn es der Donor war. Gleichzeitig ergab die PBP-Korrektur FRET-Effizienzen ungleich Null für beide Richtungen der Energieübertragung, wobei die Werte bei höheren Akzeptor-Donor-Verhältnissen höher waren, wie es aufgrund dieser Stöchiometrie zu erwarten wäre. Dies unterstreicht die Unterlegenheit der AVG-Autofluoreszenzkorrektur gegenüber der PBP-Korrektur. Tatsächlich lagen die mit PBP-Autofluoreszenzkorrektur ermittelten FRET E-Werte für alle vier Proben im mittleren Bereich, während diejenigen ohne Korrektur oder mit AVG-Korrektur je nach Signal/Autofluoreszenz-Verhältnis im Extrembereich lagen (Abb. 5b). Wo das Signal/Autofluoreszenz-Verhältnis im Donorkanal höher war, ergab keine Korrektur die höchsten FRET-Werte und eine AVG-Korrektur die niedrigsten, und umgekehrt führte bei den Proben, bei denen die Signal/Autofluoreszenzwerte im Akzeptorkanal höher waren, eine AVG-Korrektur höhere Werte und keine Korrektur bei niedrigeren FRET-Effizienzen.

FRET gemessen mit Mikroskopie an adhärenten Zellen zwischen biologisch relevanten Molekülen und an Positivkontrollen. FRET wurde zwischen EGFR und ITGA5 oder ITGB1 in beide Richtungen sowie zwischen primären und sekundären Antikörpern gemessen, die an jedes dieser molekularen Ziele für Positivkontrollen gebunden waren. (a) FRET-Effizienz berechnet ohne AF-Korrektur, durchschnittliche AF-Korrektur und pixelweise AF-Korrektur. Fehlerbalken entsprechen einem Konfidenzintervall von ± 95 % aus 12 Bildern, die jeweils mindestens 5 Zellen enthalten. (b) Fluoreszenzsignal relativ zur Autofluoreszenz in den Donor-, Transfer- und Akzeptorkanälen der Proben in (a). Die Mittelwerte aller Bilder in jeder Kategorie werden als Geigendiagramme angezeigt.

Wir haben auch die FRET-Effizienz an Positivkontrollproben gemessen und berechnet (Abb. 5a, rechtes Feld). Das gemessene Akzeptor/Donor-Verhältnis war für alle drei Proben identisch (ergänzende Abbildung 3), was darauf hinweist, dass die Unterschiede in der FRET-Effizienz nicht durch die Stöchiometrie der Farbstoffe erklärt werden können. Die AVG-korrigierten FRET-Effizienzen folgten den Trends der Signal-/Autofluoreszenzwerte in den FRET- und Akzeptorkanälen, während die nicht korrigierten Werte keinem klaren Trend folgten. Die PBP-Korrektur ergab FRET E-Werte unabhängig von den Signal/Autofluoreszenz-Verhältnissen. Bemerkenswerterweise führte dies zu sehr ähnlichen FRET-Effizienzen sowohl für monoklonale Maus-Primärantikörper (Anti-EGFR und Anti-ITGB1) als auch für Anti-ITGA5, einen monoklonalen Rattenantikörper. Unter der Annahme, dass die Komplexe aus Donor-markierten Primär- und Akzeptor-markierten Sekundärantikörpern ähnlicher sind, wenn die gleiche Mischung aus Sekundärantikörpern verwendet wird, ist der Unterschied zwischen Anti-Ratten- und Anti-Maus-Antikörper-enthaltenden FRET-Komplexen akzeptabel. Gleichzeitig zeigen die nahezu identischen Werte für die beiden Anti-Maus-Sekundärantikörper deutlich, dass die PBP-Autofluoreszenzkorrektur der AVG-Korrektur und keiner Korrektur überlegen ist.

Für die weitere Analyse wurde die EGFR → zweite Antikörperprobe verwendet. In Abb. 6a sind zwei interessierende Regionen (ROI) zusammen mit ihren FRET-E-Histogrammen dargestellt. eine mit hoher und eine mit niedriger Autofluoreszenz. Es werden auch Histogramme für die gesamten Bilder angezeigt. PBP-korrigierte Histogramme zeigen eine ähnliche Verteilung sowohl für die Bereiche mit niedrigem und hohem AF als auch für das gesamte Bild. Allerdings führt keine Korrektur zu Verzerrungen für den ROI mit hoher Autofluoreszenz, während die AVG-Korrektur ähnliche Anomalien bei niedrigen Autofluoreszenzintensitäten erzeugt. Um eine quantitativere Ansicht zu erhalten, wurden alle Pixel sowohl der EGFR-basierten als auch der ITGB1-basierten Positivkontrollproben zusammengefasst und in Bereiche mit hoher, mittlerer und niedriger Autofluoreszenz sortiert. Ihre FRET E-Histogramme sind in der ergänzenden Abbildung 4 zu sehen. Die Mittelwerte der gepoolten Pixel und ihre 95 %-Konfidenzintervalle, die ohne Korrektur, mit AVG- und mit PBP-Korrektur erhalten wurden, sind in Abb. 6b dargestellt. Ohne AF-Korrektur berechnete FRET-Effizienzen sind umgekehrt proportional zur Autofluoreszenz. Während sie im Bereich mit niedrigem AF mit dem PBP-korrigierten Bereich überlappen, werden sie mit zunehmender Autofluoreszenz zunehmend unterkorrigiert. Im Fall der AVG-Korrektur liegen die globalen Mittelwerte der FRET-Effizienzen für die Proben mit niedriger und hoher Intensität weit auseinander und sind im Allgemeinen überkorrigiert. Mit der PBP-Korrektur liegen die globalen Durchschnittswerte der beiden Proben mit niedriger und hoher Intensität jedoch sehr nahe beieinander und es gibt keinen tendenziellen Einfluss der Autofluoreszenz auf die berechnete FRET-Effizienz.

Einfluss der Autofluoreszenzintensität auf FRET, berechnet mit verschiedenen Korrekturmethoden. (a) Beispielbilder der 4 Fluoreszenzkanäle, die für die FRET-Messungen verwendet wurden (EGFR → 2. Antikörper). ROI 1: geringe Autofluoreszenz; ROI 2: hohe Autofluoreszenz. Die pixelweise Verteilung von FRET E für jede Korrekturmethode wird für das gesamte Bild und für die ROIs mit niedrigem und hohem AF angezeigt. (b) Pixel von jeweils 12 Bildern von Proben, die mit EGFR und ITGB1 (niedriges bzw. hohes Signal) hergestellt wurden, wurden gepoolt und in niedrige (− 10–1.200), mittlere (1.200–2.400) und hohe (2.400–max) Autofluoreszenz aufgeteilt Bereiche. Für jeden Bereich und jede Probe werden die mit den drei AF-Korrekturoptionen berechneten durchschnittlichen FRET E (Fehlerbalken, die ein Konfidenzintervall von ± 95 % darstellen) dargestellt. Der globale Durchschnitt für jede Stichprobe und jede Korrekturmethode wird ebenfalls dargestellt (gestrichelte Linien), wobei das 95 %-Konfidenzintervall als Bänder derselben Farbe dargestellt wird.

Trotz wichtiger Fortschritte bei der genauen Messung der FRET-Effizienz in autofluoreszierenden Proben28 stand der Mikroskopie-/Biologengemeinschaft bisher keine relativ einfache Methode und Software zur AF-Korrektur zur Verfügung, die mit allgemein verfügbaren Geräten verwendet werden kann. Hier stellen wir eine Open-Source-Lösung für die pixelweise Autofluoreszenzkorrektur bei FRET-Messungen in der Mikroskopie bereit und beschreiben außerdem die Vorbereitung und Validierung eines neuartigen Kalibrierungsstandardobjektträgers, der die einstimmige Bestimmung von spektralen Spillover- und Instrumentenkalibrierungsfaktoren unabhängig von der zellulären Autofluoreszenz ermöglicht. Basierend auf diesen Assets demonstrieren wir anhand verschiedener Modellsysteme die Vorteile der pixelweisen Autofluoreszenzkorrektur.

Zunächst haben wir eine Reihe sekundärer Antikörpermischungen mit unterschiedlichen Anteilen an mit Akzeptor und Donor markierten Molekülen verwendet, die einen Bereich von FRET-Effizienzen von 0 bis maximal umfassen, und diese an primäre Antikörper auf Zellen und Perlen gebunden. Unter Verwendung von Durchflusszytometriemessungen als Referenz stellten wir fest, dass die mikroskopische Bestimmung von FRET E unabhängig von der tatsächlichen FRET-Effizienz ohne pixelweise AF-Korrektur immer ungenauer wurde, wenn das Signal-Autofluoreszenz-Verhältnis unter ~ 100 sank. Da in biologischen Systemen von Interesse das Signal zur Autofluoreszenz oft in diesem Bereich liegt, haben wir als nächstes solche Modelle untersucht, die pathologisch wichtige EGFR-Integrin-Wechselwirkungen aufweisen33,34. Hier haben wir gezeigt, dass eine pixelweise AF-Korrektur die Genauigkeit der FRET-E-Berechnung erhöht und den Bias beseitigt, der umgekehrt proportional zum Signal-AF-Verhältnis ist.

Insgesamt kommen wir zu dem Schluss, dass der Ansatz der pixelweisen Autofluoreszenzkorrektur besonders für Fälle stark variabler zellulärer Autofluoreszenz und für Proben mit niedrigem Signal-Autofluoreszenz-Verhältnis empfohlen wird, was typisch für physiologische Expressionsniveaus ist. Mit dem Aufkommen von Fluoreszenz-Pathologie-Scannern wird die Herausforderung der Korrektur räumlich unterschiedlicher Autofluoreszenz immer dringlicher, da der mit solchen Geräten in Gewebeschnitten gemessene FRET langfristig leicht zu einem diagnostischen Ansatz werden könnte33,35.

Alle Reagenzien, sofern nicht anders angegeben, wurden von Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA bezogen.

Trastuzumab (Herceptin®, Roche, bindet HER2); Pertuzumab (Perjeta®, Roche, bindet HER2); TS2/16.2.1-Maus-Monoklonal, intern aus Hybridom hergestellt (ATCC-Kat.-Nr. HB-243, bindet Integrin β1); BIIG2-monoklonale Ratte, intern aus Hybridom hergestellt (DSHB-Antikörperregister-ID: AB_528155, bindet α5-Integrin); monoklonaler ab528-Maus-Antikörper, der intern aus Hybridomen hergestellt wurde (ATCC-Kat.-Nr. HB-8509 bindet: epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor EGFR); mit Alexa Fluor 546 konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (H + L), stark kreuzadsorbiert (ThermoFisher-Kat.-Nr. A- 11030); Alexa Fluor 647 konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (H + L), stark kreuzadsorbiert (ThermoFisher Kat.-Nr. A-21235); Alexa Fluor 546 konjugiertes Ziegen-Anti-Human-IgG (H + L), stark kreuzadsorbiert (ThermoFisher Kat.-Nr. A-21089); Alexa Fluor 647 konjugiertes Ziegen-Anti-Human-IgG (H + L), stark kreuzadsorbiert (ThermoFisher Kat.-Nr. A-21445);Alexa Fluor 647 konjugiertes Ziegen-Anti-Ratten-IgG (H + L), stark kreuzadsorbiert (ThermoFisher Kat.-Nr. A -21247).

Monoklonale Antikörper (Trastuzumab; Pertuzumab; ab528; TS2) wurden gemäß den Empfehlungen des Herstellers mit Alexa Fluor 546 oder Alexa Fluor 647 Succinimidylester (ThermoFisher Cat# A20002 & A20006) markiert und dann auf einer Sephadex G50-Säule (Cat# 9048-71-) gereinigt. 9). Der resultierende Protein- und Farbstoffgehalt wurde mit einem NanoDrop ND-1000-Spektrophotometer gemessen. 5 µl konjugierte Antikörperlösung wurden in 45 µl Lösungsmittel verdünnt, bestehend aus 0,3 m/m % BSA (VWR Chemicals Kat.-Nr. 0332-100G) und 70 % Mowiol Antifade, bestehend aus 0,1 M TrisHCl, pH 8,5, 25 % (w/v) Glycerin, und 10 % Mowiol 4-88, Polysciences, Warrington, PA, USA in PBS. 30 µl dieses verdünnten Antikörpers wurden auf einen Objektträger pipettiert und mit mit Aceton gereinigten runden Glasdeckgläsern mit 12 mm Durchmesser (0,17 mm Dicke) bedeckt. Die Proben wurden über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet und anschließend bei 4 °C gelagert. Zur Bestimmung des Instrumentenhintergrunds wurde ein nicht fluoreszierender Objektträger hergestellt, indem das 5 µl Antikörperkonjugat durch das gleiche Volumen von 1 m/m % BSA in PBS ersetzt wurde.

A172-Glioblastomzellen (ATCC Cat# CRL-1620) und SKBR3-Brustkrebszellen (ATCC Cat# HTB-30) wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, bei 37 °C mit 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator für 2 Tage in T75 kultiviert Zellkulturflaschen oder auf sterilisierten runden Glasdeckgläsern mit 12 mm Durchmesser (0,17 mm Dicke).

In einem T75-Kolben gezüchtete Zellen wurden mit 5 ml HEPES-Puffer, ergänzt mit 4 mM Glucose, gespült und dann mit 0,5 g/dm3 Trypsin (Kat.-Nr. 27250018) und 0,2 g/dm3 EDTA (Kat.-Nr. 15576028) in 1 ml steril gefiltertem PBS behandelt für 5 Min. bei 37 °C. Die abgelösten Zellen wurden gesammelt und 5 Minuten lang bei 4 °C in HEPES-Puffer, ergänzt mit 4 mM Glucose, bei 200 g in einem 15-ml-Standardröhrchen gewaschen. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde resuspendiert und in 1 ml 1 % Formaldehyd in HEPES-Puffer 15 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert. Die Zellen wurden erneut 5 Minuten lang in HEPES-Puffer bei Raumtemperatur gewaschen. Die A172- und SKBR3-Zellen wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einer Endkonzentration von 20 µg/ml an ab528 bzw. Trastuzumab markiert, dann mit HEPES-Puffer, ergänzt mit 4 mM Glucose, gewaschen und bei 200 g zentrifugiert. Für die sekundäre Fluoreszenzmarkierung wurden A172-Zellen mit unterschiedlichen Anteilen an Ziegen-Anti-Maus-Antikörpern, konjugiert mit Alexa Fluor 546 oder Alexa Fluor 647, in einer Gesamtkonzentration von 10 µg/ml markiert. SKBR3-Zellen wurden auf die gleiche Weise markiert, außer dass Ziegen-Anti-Human-Antikörper verwendet wurden. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen wie zuvor beschrieben gewaschen und die Pellets in 150 µl HEPES-Puffer mit 1 % Formaldehyd resuspendiert. Nicht markierte Kontrollen wurden nach dem gleichen Protokoll hergestellt, jedoch ohne Antikörper.

Die Markierung der mit Protein G beschichteten Perlen (Bangslabs Protein G Antibody Binding Beads, Kat.-Nr. 554) folgte einem ähnlichen Protokoll, jedoch ohne Anwendung des ersten Fixierungsschritts. Die primären Antikörperkonzentrationen betrugen 100 µg/ml, um eine Sättigungskonzentration zu erreichen (ergänzende Abbildung 5).

20 µl jeder Probe (Zellen und Perlen) wurden mit 20 µl Mowiol Antifade gemischt. 30 µl dieser Mischung wurden auf einen Superfrost-Glasobjektträger pipettiert und mit mit Aceton gereinigten runden Glasdeckgläsern mit 12 mm Durchmesser (0,17 mm Dicke) bedeckt. Die Objektträger wurden über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet und bei 4 °C gelagert.

Die Objektträger wurden mit einem Zeiss LSM 880 Laser-Scanning-Mikroskop abgebildet. Die verbleibenden unmontierten Probensuspensionen wurden mit einem ACEA NovoCyte RYB-Durchflusszytometer gemessen.

Auf runden Glasdeckgläsern mit 12 mm Durchmesser kultivierte A172-Zellen wurden aus dem Medium entfernt und auf eine eiskalte, mit Parafilm beschichtete Metalloberfläche gelegt und mit HEPES-Puffer, ergänzt mit 4 mM Glucose, gewaschen. Die Zellen wurden 15 Minuten lang bei 4 °C mit 1 % Formaldehyd in HEPES-Puffer fixiert und dann dreimal mit HEPES-Puffer (2, 3 und 7 Minuten lang) bei Raumtemperatur gewaschen. Alle aufeinanderfolgenden Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Zur direkten Markierung wurden die Zellen 30 Minuten lang mit Donor- und Akzeptor-markierten Antikörpern markiert, jeweils mit einer Endkonzentration von 20 µg/ml in HEPES-Puffer mit 2 % BSA, unter Verwendung der folgenden Kombinationen: ab528-Alexa Fluor 546 + BIIG2-Alexa Fluor 647; ab528-Alexa Fluor 647 + BIIG2-Alexa Fluor 546; ab528-Alexa Fluor 546 + TS2-Alexa Fluor 647; ab528-Alexa Fluor 647 + TS2-Alexa Fluor 546. Zur indirekten Markierung wurden die Primärantikörper ab528-Alexa Fluor 546, BIIG2-Alexa Fluor 546 und TS2-Alexa Fluor 546 auf die gleiche Weise mit einer Endkonzentration von 20 µg/ml verwendet. Nach diesem Markierungsschritt wurden die Zellen erneut dreimal (2, 3 und 7 Minuten lang) mit HEPES-Puffer gewaschen. Im Fall der indirekten Markierung folgte ein ähnlicher Markierungszyklus mit 10 µg/ml konjugierten Alexa Fluor 647-Sekundärantikörpern, die für den Primer-Antikörper geeignet waren, verdünnt in HEPES mit 2 % BSA für 30 Minuten. Nach dem letzten Waschen folgte die 15-minütige Fixierung in 1 % Formaldehyd in HEPES-Puffer und die Montage auf Superfrost-Glasobjektträgern mit Mowiol. Zur Bestimmung von Korrekturfaktoren und Emissionsspektren wurden auch einzeln markierte und unmarkierte Kontrollen vorbereitet.

Die gesamte Bildgebung erfolgte mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (LSM 880, Carl Zeiss GmbH, Jena, Deutschland) unter Verwendung eines 40× C-Apochromat-Wasserimmersionsobjektivs (NA = 1,2, Artikel-Nr.: 421767-9971). Die Lochblenden wurden auf eine Schichtdicke von 1 µm und die Pixelgröße auf 100 nm eingestellt (optimale Abtastung auf Nyquist-Basis). Zur spektralen Auflösung der Autofluoreszenz wurde die Emission nicht gefärbter Zellen auf einem 32-Elemente-GaAsP-Array des Mikroskops mit einer Schrittweite von 8,92 nm aufgelöst, wobei nacheinander 488, 543 und 633 nm Anregung verwendet wurden. Die gleiche Datenerfassungsstrategie wurde zur Überprüfung der spektralen Stabilität der Donor- und Akzeptor-Emission auf Standardobjektträgern und markierten Zellen eingesetzt.

Für die FRET-Messungen arbeitete das Mikroskop im Zeilenscanmodus und alle Fluoreszenzkanäle wurden vom 32-Kanal-GaAsP-Detektor des Instruments erfasst. Im Autofluoreszenzkanal betrug die Anregung 488 nm und der Detektionsbereich 499–535 nm. Der Donor- und der Transferkanal wurden gleichzeitig mit einer Anregung von 543 nm angeregt und zwischen 553–615 nm bzw. 651–695 nm nachgewiesen. Der Akzeptorkanal wurde bei 633 nm angeregt und im Bereich von 651–695 nm nachgewiesen.

Durchflusszytometrische Fluoreszenz- und FRET-Messungen wurden mit einem NovoCyte RYB-Zytometer durchgeführt. Für die Autofluoreszenz wurde der vordefinierte FITC-H-Kanal des Instruments verwendet (Anregung bei 488 nm und Detektion bei 515–545 nm); der Donorkanal war PE-H (Anregung bei 561 nm und Detektion bei 576–596 nm); der Übertragungskanal war PE-Cy5 mPlum-H (Anregung bei 561 nm und Detektion bei 650–670 nm); und der Akzeptorkanal APC-H (Anregung bei 640 nm und Detektion bei 650–670 nm). Zur Auswertung wurde die Gating- und Korrekturfaktorbestimmung in FCS Express v7 vorgenommen. Die Gated-FRET-Proben wurden in CSV exportiert, die FRET-Berechnungsformeln (siehe Gleichungen) wurden in MS Excel angewendet und dann wurden die neu erstellten FRET-Listenmodusdaten zur Visualisierung in FCS Express importiert.

Die gesamte Bildanalyse wurde mit Fidschi (https://fiji.sc/)36 durchgeführt. Ein zuvor in unserem Labor erstelltes Plugin zur Berechnung des herkömmlichen spektralen Spillover-korrigierten quantitativen (3-Filter) FRET (RiFRET16) wurde neu geschrieben, um eine pixelweise Autofluoreszenzkorrektur einzubeziehen und eine vollautomatische Verarbeitung größerer Datenmengen zu ermöglichen Bildsätze zu erstellen und mit ImageJ 2.0 kompatibel zu sein. Der Quellcode ist auf GitHub (https://github.com/CellMoTher/RiFRET) verfügbar und das Plugin ist über die Update-Site „FRET Imaging“ in Fidschi verfügbar.

Die in dieser Studie generierten und analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Es wurden keine für öffentliche Datenbanken relevanten Daten generiert.

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István Rebenku, Cameron B. Lloyd, János Szöllősi und György Vereb

ELKH-DE Forschungsgruppe Zellbiologie und Signalübertragung, Medizinische Fakultät, Universität Debrecen, Egyetem tér 1, Debrecen, 4032, Ungarn

István Rebenku, János Szöllősi & György Vereb

Fakultät für Pharmazie, Universität Debrecen, Egyetem tér 1, Debrecen, 4032, Ungarn

George Sparrow

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Korrespondenz mit György Vereb.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Rebenku, I., Lloyd, CB, Szöllősi, J. et al. Pixelweise Autofluoreszenz-korrigierter FRET in der Fluoreszenzmikroskopie verbessert die Genauigkeit für Proben mit räumlich unterschiedlichem Autofluoreszenz-Signal-Verhältnis. Sci Rep 13, 2934 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30098-w

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Eingegangen: 23. August 2022

Angenommen: 14. Februar 2023

Veröffentlicht: 20. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30098-w

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